医学分子生物学

医学分子生物学

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范文一:医学分子生物学

医学分子生物学重点

名词解释

1. 顺式调节:一个基因的调控区和结构基因位于同一个DNA分子中的相邻部位,这种调节方式称为顺式调节。

2. 开放阅读框架(ORF):在mRNA分子中,密码子之间没有间隔核苷酸,从起始密码子开始每三个核苷酸为一个密码子连续阅读,直至终止密码子出现,这一段核苷酸序列被称为开放阅读框架。ORF通常是从mRNA分子5’端的第一个AUG开始,每三个核苷酸为一组,决定肽链上的一个氨基酸,直至终止密码子结束。

3. RNA组学是研究各种细胞内具有重要功能的非编码小RNA的种类、结构和功能的前沿学科。

4. 基因组:细胞或生物体中,一套完整单倍体的遗传物质的总和。如真核细胞基因组包含细胞核染色体DNA及线粒体DNA,原核细胞基因组包含染色体DNA和质粒DNA.

5. 假基因:与有功能的基因同源,但不能产生有功能的基因产物的基因。

6.卫星DNA:是基因组的一种高度重复序列,其重复单位一般由2~10bp组成,成串排列,具有调节基因的复制和转录功能。 7. 半不连续复制:DNA复制时,一条链(前导链)连续合成,另一条链(随后链)不连续合成。

8. 端粒酶:是一种逆转录酶,由RNA和蛋白质组成,能以所含的RNA为模板逆转录合成真核生物染色体的端粒DNA重复序列,保证染色体复制的完整性。

9 . DNA损伤:各种内外因素所导致的DNA结构和组成的变化。

10.移码突变:在编码序列中,单个碱基、数个碱基及片段的缺失\插入可以使突变位点之后的三联体密码阅读框架发生改变,不能编码原来的蛋白质。

11.TATA盒:真核生物转录起始点上游与RNA聚合酶、基本转录因子相结合的DNA片段,含有TATA共有序列,是Ⅱ类启动子的重要组成部分,又称为Hogness盒。

12.RNA编辑:指细胞中初级转录产物hnRNA的序列改变,使C变为U或者A变为G,结果一个基因表达产生不止一种蛋白质,增加了遗传信息容量。

13.单顺反子:真核生物中一条mRNA模板只含有一个翻译起始点和一个终止点,因为只能翻译出一条多肽链,这种mRNA被称为单顺反子。

14.操纵子:原核生物绝大多数基因按照功能相关性成簇串联排列,与启动子、操纵基因等调控元件共同组成一个转录单位,实现协调表达。

15.组成性表达:某些基因产物对生命全过程都是必需的或必不可少的。这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达,通常称为管家基因。管家基因较少受环境因素影响,而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达或变化很小。区别于其它基因,这类基因的表达称组成性表达或基本的基因表达。

16.反义RNA:细菌中的某些RNA分子,含有与特定mRNA翻译起始部位互补的序列,通过与mRNA杂交阻断30S小亚基对起始密码子的识别及与SD序列的结合,抑制翻译起始。

17.RNA干涉:双链siRNA参与RNA诱导的沉默复合体(RISC)组成,与特异的靶mRNA完全互补结合,导致靶mRNA降解,阻断翻译过程。这种siRNA介导的基因表达抑制作用即为RNA干涉。

18.受体:细胞膜上或细胞内部能识别生物活性物质并与之结合,进而引起生物学效应的蛋白质或糖脂称为受体。

19.配体:能与受体呈特异结合的生物活性分子称为配体。

20.基因组文库:是指含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体。构建基因组文库时,需要先提纯原核或真核细胞的基因组DNA,然后用机械法或酶解法将基因组DNA切割成大小不等的许多DNA片段,再将其插入到适当的克隆载体中,继而转入受体菌中进行扩增。存在于转化细菌内,由克隆载体所携带的所有基因组DNA片段的集合称基因组DNA文库,它包括了基因组全部基因信息。

21.基因克隆:是指将一个生物体的遗传信息(基因片段)通过无性繁殖转入另一个生物体内的过程,通过基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段,由于基因的化学本质是DNA,因此也称其为DNA克隆。

1. 简要回答DNA双螺旋结构的三个要点

① DNA是反向平行的互补双链,一条链从上往下走向是5’到3’,另一条链是从下往上也是5’到3’,碱基位于双螺旋内侧,亲水

性的脱氧核糖和磷酸骨架则位于双螺旋外侧,两条链碱基之间以氢键连接,A与T配对形成2个氢键,C与G配对形成3个氢键。碱基平面与螺旋纵轴垂直。

② DNA分子的两条脱氧核苷酸链反向平行围绕同一中心轴旋转,呈右手螺旋。DNA双螺旋分子表面形成一个大沟和小沟。

③ 疏水性碱基堆积力和氢键是DNA双螺旋结构的稳定力:DNA双链结构的横向稳定依靠两条链互补碱基间的氢键维系,纵向则靠碱

基平面的堆积力维持。碱基堆积力对于双螺旋的稳定性更为重要。

2.基因的功能

1)利用四种碱基的不同排列荷载遗传信息。

2)通过复制将所有的遗传信息稳定、忠实的遗传给子代细胞。同时为了适应环境变化,生物体的遗传性和变异性同时存在。

3)作为基因表达的模板

3.简述质粒的基本特征:

1)原核细胞染色体外的共价闭合的环状DNA分子2)能够独立于细胞的染色体而进行复制,并依赖于宿主细胞3)其所带的遗传信息能够赋予宿主细胞特定的遗传性状4)在宿主菌中具有不相容性5)是DNA重组技术中所使用的主要载体

4.真核生物染色体中结构基因的特点:

1)通常为断裂基因 2)转录产物多为单顺反子3)在基因组所占比例较小

5.试述原核生物与真核生物基因组结构的不同之处:

(1)真核生物基因组的结构特点:1)转录产物多为单顺反子RNA 2)基因是不连续的,内部存在不编码蛋白质的内含子 3)存在大量的重复序列 4)编码区域所占比例较小 5)基因组远大于原核生物基因组,具有许多复制起点

(2)原核生物基因组的结构特点: 1)转录产物多为多顺反子 2)编码区域所占比例较大基因是连续的,不含内含子 3)重复序列很少4)编码区域所占比例较大5)基因组较小,只有一个复制起点

6.试述DNA复制的共同特点

① 半保留复制方式保证了遗传信息的忠实传递

② 基因组DNA都有固定的复制起始点

③ 复制子是复制基本单位

④ 双向复制形成复制泡和复制叉

⑤ 半不连续复制方式克服了DNA空间结构对DNA新链合成的制约

7.试述真核生物染色体DNA与原核生物染色体DNA复制的不同点:

1)复制起点 原核生物为一个,真核生物为多个2)复制叉移动速度 原核生物快,真核生物慢3)复制方向 原核生物双向,真核生物大多为双向4)RNA引物 原核生物长,真核生物短5)冈崎片段 原核生物长,真核生物短6)连续起始 原核生物可连续复制,真核生物不可以

8.DNA损伤的因素分为外源性因素和内源性因素。

外源性因素主要有物理因素、化学因素和生物因素。包括电离辐射、紫外线、碱基类似物、碱基修饰剂、某些化学染料、自由基和病毒等。

内源性因素主要有:机体代谢过程产生的有毒物质,复制过程中碱基的错配,DNA本身的热不稳定因素等

9.比较原核细胞与真核细胞基因转录方面存在的主要差异

1)真核基因转录涉及核小体结构解聚过程。2)原核转录与翻译偶联;真核转录在细胞核中进行3)原核1种RNA聚合酶(α2ββσ);真核3种RNA聚合酶(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)分别负责不同基因的转录4)原核RNA聚合酶直接结合启动子,转录起始的特异性主要取决于σ因子;真核RNA聚合酶借助基础转录因子结合启动子,转录起始的特异性主要取决于特异转录因子。5)原核基因转录的产物是多顺反子RNA;真核基因转录的产物是单顺反子RNA

6)原核mRNA不需加工;真核mRNA需加帽、加尾、剪接、编辑。

10.比较原核细胞与真核细胞基因翻译方面有何不同

1)原核转录与翻译偶联;真核翻译在细胞质中进行。2)原核mRNA通过SD序列在核蛋白体上就位;真核mRNA通过5’端帽子-帽子结合蛋白复合物在核蛋白体上就位 3)原核起始tRNA携带N-甲酰蛋氨酸(识别AUG/GUG/UUG);真核起始tRNA携带蛋氨酸(识别AUG)。

4)原核核蛋白体70S(30S+50S);真核核蛋白体80S(40S+60S)。 5)原核3种起始因子(IF1、IF2和IF3);真核10余种起始因子(eIFn)。

6)原核2种延长因子(EFT和EFG);真核2种延长因子(EF1和EF2)。 7)原核3种释放因子(RF1、RF2和RF3);真核1种释放因子(eRF)。

11.简述乳糖操纵子得调节机制

1)乳糖操纵子包含3个结构基因(编码β-半乳糖苷酶、β-半乳糖通透酶和转乙酰基酶)、3个调控元件(启动子、操纵基因和CAP结合位点)和一个调节基因(编码阻遏蛋白)。 2)阻遏蛋白的负调控:无乳糖时,阻遏蛋白结合操纵基因,妨碍RNA聚合酶结合启动子,抑制结构基因转录。有乳糖时,生成别位乳糖(诱导剂)结合阻遏蛋白,不能封闭操纵基因,结构基因可以转录。 3)cAMP-CAP结合物的正调控:无葡萄糖时cAMP浓度高,形成的cAMP-CAP复合物结合于CAP结合位点,增强启动子转录活性。有葡萄糖时,cAMP浓度低,cAMP-CAP复合物形成受阻,影响转录活性 4)正、负调控机制相辅相成。cAMP-CAP复合物是转录必需的,同时阻遏蛋白进一步控制转录启动。

综上,乳糖操纵子最强的表达条件是有乳糖而无葡萄糖。

12.试述原核基因表达调控与真核基因表达调控的区别

1)相同点:转录起始是基因表达调控的关键环节

2)不同点:

①原核基因表达调控主要包括转录和翻译水平;真核基因表达调控包括染色质活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工多个层

次。

②原核基因表达调控主要为负调节;真核基因表达主要为正调节。

③原核转录起不需要转录因子,RNA聚合酶直接结合启动子,由σ因子决定基因表达的特异性;

真核转录起始需要基础、特异两类转录因子,依赖DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用,调控转录激活。

④原核基因表达调控主要采用操纵子模型,转录出多顺反子RNA,实现协调调节;

真核基因转录为单顺反子RNA,功能相关蛋白质的协调表达机制更为复杂。

13.单跨膜受体介导的信号传导途径作用的基本模式:胞外信号分子与受体结合,第一个蛋白激酶被激活,磷酸化修饰激活蛋白激酶,蛋白激酶作用于效应分子引起生物效应

14.简述通过胞内受体传递信息的机制

1)信息分子;2)胞内受体;3)受体激活及作用;4)诱导蛋白的作用

15.简述基因克隆的基本步骤:1)目的基因的获取;2)克隆载体的选择与构建;3)外源基因与载体的连接;

4)重组DNA导入受体菌;5)重组体的筛选

论述题(答案仅参考)

1.如何利用PCR技术进行基因定向突变

将要进行定点突变的序列设计在引物上面 通过PCR扩增目的基因,连接T载体测序,确定成功突变后 在进行相关表达载体的构建

2.原核表达系统中影响外源基因表达效率的主要因素

主要影响因素有:启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞的生理特征等

1:简述乳糖操纵子的的调节机制

(1):乳糖操纵子包含3个结构基因分别编码B-半乳糖苷酶、B-半乳糖苷通透酶和转乙酰基酶、3个调控元件,启动子、操纵基因和CAP结合位点和1个调节基因编码阻遏蛋白。(2):阻遏蛋白的负调控:没乳糖时,阻遏蛋白结合操纵基因,妨碍RNA聚合酶结合启动子,抑制结构基因转录。有乳糖时,生成别位乳糖结合阻遏蛋白,不能封闭操纵基因,结构基因可以转录。(3):cAMP-CAP复合物的正调控:无葡萄糖时cAMP浓度高,形成的cAMP-CAP复合物结合于CAP结合位点,增强启动子转录活性。(4):正、负调控机制相辅相成。cAMP-CAP复合物是转录必须的,同时阻遏蛋白进一步控制转录启动。综上,乳糖操纵子最强的表达条件是有乳糖而无葡萄糖。 2:简述顺式作用元件与反式作用因子对基因表达调控的影响。

(1):真核基因的转录激活受顺式作用元件和反式作用因子相互作用的调节。(2):顺式作用元件是指起转录调控作用的DNA 序列,包括启动子、增强子和沉默子等。(3):反式作用因子是指起转录调控作用的蛋白质,又称为转录因子,包括基础转录因子和特异转录因子。(4)

:顺式作用元件与反式作用因子之间的作用形式包括DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用。(5):DNA-蛋白质相互作用体现在:启动子和核心序列与基础转录因子结合,是RNA聚合酶结合所必需的;转录非核心序列与特异转录因子结合,调控的特异性表达。(6):蛋白质-蛋白质相互作用体现在:转录因子之间排列组合产生协同,竞争或者拮抗,决定基因转录的特异性。

3:G蛋白如何调控细胞膜上腺苷酸环化酶的活性

很多激素货递质的受体通过调节细胞膜上的腺苷酸环化酶(AC)活性产生效应。有两类G蛋白介导激素,受体等对AC的作用。一类是介导激活AC作用的Gs,另一类是介导抑制AC作用的Gi。

4:PCR技术

分为变性,退火,延伸3个步骤。将PCR反应体系升温至95℃左走,双链的DNA 模板就解开成两条单链,此过程为变性。然后将温度降至引物的KM值一下,3'端和5'端的引物个自与两条单链DNA模板的互补区域结合此过程为退火。当将反映体系的温度升至70℃左右时耐热的DNA聚合酶催化四种dNTP按照模板DNA的核酸序列的互补方式依次加至引物的3'端,形成新的DNA链。以此方式经过多次循环课得到大量的模板DNA拷贝。

范文二:医学分子生物学

BIOL8107 医学分子生物学

Medical Molecular Biology

开课院系:医学院 任课教师:查锡良教授等

开课学期:第二 学分:3 周学时:4 总学时:54 课程性质:博士学位基础课

适用专业:生物化学与分子生物学(医)及其他医学基础学科

本课程的教学目的

通过讲授及讨论医学分子生物学某些重要领域的新进展,使研究生了解这些领域先进的研究技术,熟悉它们的基础研究及应用研究现状。对研究生目前及将来的研究工作有直接或间接的指导意义。、

教学内容及基本要求

内容:1,基因结构与功能及基因组;2,基因表达调控及脂肪细胞发育;3,蛋白质结构与功能及蛋白质折叠与疾病;4,酶的催化作用和特殊生物学功能;5,细胞周期与分化;6,细胞凋亡共6个论题,每个论题均组织一次新文献讨论。

要求:熟悉分子生物学在上述领域中的新进展,探讨如何结合自身的研究工作引入新技术、新概念。

考核方式及要求

考试。

学习本课程的前期课程要求

掌握基本的生化与分子生物学知识。

教材及主要参考书目、文献与资料

查锡良教授主编《医学分子生物学》人民卫生出版社。

Robert F. 《Molecular Biology》科学出版社。

范文三:医学分子生物学

中心法则

DNA 双螺旋结构

⑴ DNA 由两条反相平行的脱氧核苷酸链组成,脱氧核糖-磷酸骨架位于双链的外侧,碱基位于内侧,

双链的碱基之间以氢键相结合。 碱基互补配对形式:A  T; G  C

⑵ DNA 是右手螺旋结构,螺旋直径为2nm,螺距为3.4nm。

碱基平面垂直螺旋轴,相邻碱基平面距离为0.34nm,螺旋一圈包含10对碱基。

⑶ 氢键维持 DNA 双链横向稳定性,碱基堆积力维持双链纵向稳定性。

核小体(nucleosome)真核生物染色质由DNA和蛋白质组成,其基本单位是核小体。各两分子H2A、H2B、 H3和H4组成八聚体的核心组蛋白,双链DNA缠绕在这一核心上形成核心颗粒。颗粒之间由H1组蛋白 和DNA形成的链接区形成串珠样结构。

DNA变性 在某些理化因素作用下,DNA双键间的氢键断裂,DNA双链解开成两条单链的过程。 DNA复性(renaturation)在适当条件下,变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象。

融解温度(melting temperature, Tm)DNA变性是在一个相当窄的温度范围内完成的,在这一范围内,紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度叫DNA的解链温度。其大小与G+C含量成正比。

基因(genes)指存在于DNA分子上编码RNA或多肽链的功能区段,包括编码序列(外显子)、侧翼序列(含有调控序列)及插入序列(内含子)。基因是决定遗传性状的功能单位。

结构基因(structure genes)基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列。

断裂基因(split gene)真核生物的结构基因由外显子和内含子两部分组成,编码序列不连续。

外显子(exon)编码氨基酸序列,在基因转录后经过剪接连在一起,形成成熟的mRNA,最终参与指导多肽链合成。

内含子(intron)非编码序列,在基因表达中起作用,有些内含子可为酶编码。

内含子和外显子一起转录成mRNA前体,但是内含子序列在mRNA前体的转录后加工过程中被剪切掉,不存在于成熟的mRNA序列中。

GT-AG法则 真核生物基因的外显子与内含子接头处都有一段高度保守的一致性序列,即:内含子5′端大多数是以GT开始,3′端大多是以AG结束。是RNA加工时剪接的信号。

顺式作用元件(cis-acting element)指那些与结构基因表达调控相关,能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列,包括启动子、启动子上游原件、增强子、反应元件、沉默子等。

启动子(promoter)是能够被RNA聚合酶特异性识别与结合并启动转录的DNA序列。

增强子(enhancer)指远离转录起点(1kb-30Kb),决定基因的时间、空间特异性表达,增强启动子转录活性的DNA序列。在基因任意位置都有效,无方向性,本身不具备启动子活性。

沉默子(silencer)/ 衰减子(dehancer)可抑制基因转录的特定序列,结合一些反式作用因子对基因的转录起阻遏作用,使基因沉默。沉默子与转录抑制因子结合后抑制基因转录,属于负性调节元件。 反式作用因子(trans-acting factors)指某些基因产物特异的识别与结合另一基因的顺式作用元件而反式激活该基因的蛋白质分子。

反式作用因子的结构:3个结构域

⑴ DNA识别结合域(锌指结构、同源结构域、碱性亮氨酸拉链、螺旋-环-螺旋结构);

⑵ 转录活性域(富含谷氨酰胺的结构域、富含脯氨酸的结构域、酸性氨基酸转录激活结构域); ⑶ 结合其他蛋白结合域。

反式作用因子的功能:

② 能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件;

③ 对基因的表达有正性或负性调控作用,激活和阻遏基因的表达。

转录因子(trans-criptional factors, TF)反式作用因子中,直接或间接结合RNA聚合酶的,则称为转录因子。 结构域(domain)蛋白质的三维结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域,折叠得较为紧密, 各行其功能,称为结构域。

多顺反子mRNA(polycistronic mRNA)原核生物的每一个mRNA分子带有几个结构基因的遗传信息,利用共同的启动子及终止信号,组成“操纵子”的基因表达调控单元。

单顺反子mRNA(monocistronic mRNA)真核生物的一个编码基因转录生成一个mRNA。

基因组(genome) 广义上指一个细胞或病毒颗粒所含DNA的全部序列(包括编码序列和非编码序列)。即遗传物质的总量。狭义上指一个细胞或病毒颗粒所含基因的总和。

操纵子(operon)多个功能相关的结构基因成簇串联排列,与上游共同的调控区和下游转录终止信号组成的基因表达单位。

操纵序列(operator)是阻遏蛋白基因表达的阻遏蛋白的结合位点。

转座作用(transposition)基因组中的一段特殊的DNA片段,它们可从一个位点转移到另一个位点。 转座子(transposon,Tn)是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。

单一序列DNA(unique sequence DNA)

卫星DNA(satellite DNA)出现在非编码区的首尾相连的串联重复序列,通常存在于间隔DNA和内含子中。具有固定的重复单位。常存在于异染色质上。分为大卫星DNA、小卫星DNA和微卫星DNA。 小卫星DNA 重复单元为15-100bp,所形成的序列长度为1-5kb,又称可变数目串联重复序列。

微卫星DNA重复单元为1-6bp,又称短串联重复序列,在基因组中出现的数目及频率存在个体间的差异,可用于检测DNA指纹。常见的重复单位是(AC)n和(TG)n,重复次数10次~60次。

端粒(telomere)真核生物染色体线性DNA分子末端由DNA和蛋白质组成的一种特殊结构,由短的高度重复序列组成,维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性。

① 保护染色体末端DNA不被核酸降解;② 避免染色体间融合。

端粒酶(telomerase)由RNA和蛋白质组成的一种很特殊的核蛋白复合物。具有逆转录酶作用。

端粒酶RNA含有与与端粒DNA互补的序列,逆转录反复延伸端粒DNA的重复序列,以补偿由除去引物引起的线性染色体末端缩短。

DNA多态性 任何两个个体之间(单卵双生两个体除外)的DNA组成都不完全相同。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是指给定人群的基因组中的给定位点上发现的单个核苷酸的变异,或称DNA位点多态性。在群体中出现的频率不少于1%。

限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)用一种限制性内切酶消化不同个体的同一段DNA时,由于碱基组成的变化而改变限制性内切酶识别位点,从而会产生长度不同的DNA片段。

多基因家族(multigene)指碱基序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的基因。编码产物具有相似的功能。

假基因 与有功能的基因结构相似,但不能表达基因产物的基因。

复制子(replicon)从一个复制起始点开始所复制的DNA分子或DNA片段。

复制叉(replication fork)复制时,自起点解开双链成两股单链而在起点两侧形成现叉状结构。

半不连续复制(semi-discontinuous replication)DNA复制过程中,在复制叉处的一条新链的合成是连续的—前导链领头链,与复制叉前进方向一致。另一条新链的合成是不连续的—尾随链,与复制叉前进方向相反。

半保留复制(semiconservative replication)在子代双链DNA分子中,一条链来自于亲代,另一条链是 新合成的。遗传信息以这种半保留复制方式忠实地从亲代传给子代。

cDNA(complimentary DNA)指以RNA为模板,经逆转录酶催化合成DNA为互补DNA。

逆转录 指以RNA为模板,在逆转录酶的催化下合成DNA过程。

S-D序列(Shine-Dalgarno sequence,核糖体结合位点)指位于原核生物mRNA起始密码(AUG)的 上游约4-13个碱基处存在的一段富含嘌呤的序列,其一致序列为-AGGAGG-,能与核糖体30S亚基中 16S rRNA 3′端富含嘧啶的序列结合,与蛋白质合成过程中起始复合物生成有关。

开放阅读框架(open reading frame,ORF)从mRNA5′端起始密码AUG到3′端终止密码子之间的 核苷酸序列,各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链,称开放阅读框架。

选择性剪接(alternative splicing)自一个mRNA前体中选择不同的剪接位点,可产生由不同外显子组 合而成的mRNA剪接异构体。选择性剪接使同一基因表达出不同的蛋白质分子。

RNA编辑(RNA editing)指改变mRNA分子中的碱基而使同一基因表达出不同的蛋白质。

分子伴侣(molecular chaperon)指促进、帮助、监视和加速蛋白质进行正确折叠的一类蛋白质分子。 热休克蛋白(HSP)、伴侣蛋白(伴侣素)

信号序列(signal sequence)所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号,主要为N末端特异氨基酸序列,可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位,这一序列称为信号序列。

信号肽(signal peptide) 指未成熟蛋白质中有一段可被细胞转运系统识别、并把后续肽链引向膜性结构的特征性的氨基酸序列。

基因表达(gene expression)指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程,合成特定的蛋白质,进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。 时间特异性(temporal specificity)按功能需要某一特定基因表达严格按特定的时间顺序发生。

空间特异性(spatial specificity)在个体生长全过程,某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现。又称细胞或组织特异性。

管家基因(housekeeping gene)某些基因几乎在所有的细胞中都以适当恒定的速率持续表达,这些基因的产物对生命的全过程都是必不可少的。

诱导表达(induced expression)在特定环境信号刺激下,有些基因的表达表现为开放或增强。

阻遏表达(repressed expression) 在特定环境信号刺激下,有些基因的表达表现为关闭或下降。 基因表达调控(Regulation of Gene Expression)生物体通过特定的蛋白质与DNA,蛋白质与蛋白

质之间的相互作用来控制基因是否表达,或调节表达产物的多少以满足生物体的自身需求以及适

应环境变化的过程。

klenow片段(DNA聚合酶Ⅰ大片段)E.coli DNA聚合酶I经部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。保留了DNA聚合酶I的5´-3´聚合酶和3´-5´外切酶活性,缺少5´-3´外切酶活性。

合成双链cDNA 的第二条链、填补双链DNA3´末端、切口平移制作探针、DNA序列分析。

核酶(ribozyme)具有催化功能的RNA分子。

点突变(point mutation)单个碱基的改变,如果位于编码区可能会影响所编码的氨基酸从而影响蛋白质功能。

融合蛋白 指表达的蛋白质由原核多肽和真核蛋白连接在一起。

基因重排(gene rearrangement)指某些基因片段改变原来存在顺序而重新排列组合,成为一个完整的转录单位,调节表达产物多样性。

转基因技术(transgene technology)是将外源基因导入受体细胞(受精卵或胚胎干细胞)中,通过外源基因与细胞染色体DNA的随机重组而使外源基因整合到染色体上,并随细胞的增殖而遗传给后代。 基因打靶(gene targeting)是利用DNA同源重组原理,定向地从细胞染色体上移除或移入特定基因的过程。包括基因敲除和基因敲入。

基因敲出(gene knockout)是利用基因体外重组技术构建基因打靶载体,然后将打靶载体导入受体细胞使之与染色体上特定的基因序列发生同源重组,从而置换特定基因使之活性丧失。

基因敲入(gene knockin)指利用DNA定点同源重组,用某一基因代替基因组中的另一基因。

原核生物核基因组特点:

⑴ 原核生物基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成,只有1个复制起始点;

⑵ 操纵子结构是原核生物基因组的结构特点之一;

⑶ 基因密度非常高,基因组序列中编码区所占的比例较大;

⑷ 在原核生物基因组中的非编码区内主要是一些调控序列;

⑸ 基因一般是连续的,无内含子,转录产物为多顺反子mRNA;

⑹ 基因组中很少有重复序列;编码蛋白质的结构基因多为单拷贝,而编码rRNA的基因往往是多拷贝。 ⑺ 细菌基因组中的可移动成分能产生转座现象;

⑻ 具有编码同工酶的基因;

⑼ DNA分子中具有多种功能识别区域,如复制起始区、终止区。

真核生物核基因组特点:

⑴ 真核生物基因组庞大、结构复杂,有多个复制起点;

⑵ 真核生物基因组中的非编码序列(内含子、调控序列和重复序列)多于编码序列;

⑶ 真核生物基因组有大量的重复序列;

⑷ 转录产物为单顺反子mRNA;

⑸ 真核基因大多是不连续的断裂基因,由外显子和内含子镶嵌而成;

⑹ 功能相关的基因构成基因家族。

原核生物基因表达特点:

⑴ 操纵子是原核生物基因转录的基本调控单元;

原核基因一般不含内含子,基因是连续的。原核基因转录单位多为多顺反子。

⑵ 原核生物mRNA的转录、翻译和降解偶联进行;

原核生物裸露的环形DNA,在拟核内转录成mRNA后,直接在细胞浆中与核糖体结合翻译为蛋白质。 ⑶ 只有一种RNA聚合酶。RNA聚合酶用来识别原核细胞的启动子,催化所有RNA的合成;

⑷ mRNA翻译起始部位有特殊的碱基序列,SD序列。

E.coli 乳糖操纵子(lactose operon,lac)

阻遏蛋白 β-半乳糖苷酶 透酶 乙酰基转移酶 乳糖操纵子由阻遏蛋白的负性调控和CAP的正性调控共同调节。

⑴ CAP的正性调控:

分解代谢物激活蛋白(CAP)活性依赖cAMP,形成cAMP-CAP复合物,与CAP结合位点结合, 激活RNA聚合酶活性,促进结构基因转录。

cAMP与Glu相关,Glu↑→cAMP↓、Glu↓→cAMP↑。

⑵ 阻遏蛋白的负性调控:

没有乳糖存在时,阻遏基因I编码的阻遏蛋白与操纵序列

O

结合,抑制RNA聚合酶与启动子P结合,抑制转录。有乳糖存在时,乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构,不能结合于操纵序列。

⑴ Glu(+)lac(+):lac.存在解除了阻遏蛋白对转录的抑制作用;Glu → cAMP↓,cAMP-CAP复合物不能形成,CAP不能结合到CAP结合位点上,转录不能启动,基因关闭。

⑵ Glu(+)lac(-):无诱导剂存在,阻遏蛋白与操纵元件结合;Glu(+)CAP不能发挥正调控作用,基因关闭。

⑶ Glu(-)lac(-):Glu(-)CAP能发挥正调控作用;lac(-)无诱导剂,阻遏蛋白负调控,基因关闭。

⑷ Glu(-)lac(+):Glu(-)CAP能发挥正调控作用;lac(+)阻遏蛋白失去负调控作用,转录开启。 真核生物基因表达的特点:

⑴ 细胞具有全能性;

全能性指同一种生物的所有细胞都含有相同的基因组DNA,都有发育成完整个体的潜能;

⑵ 基因表达的时间性和空间性;

时间性,个体发育的不同阶段,基因表达的种类和数量不同;

空间性,在不同组织和器官中,基因表达的种类和数量不同;

⑶ 转录和翻译分开进行;

真核生物DNA在胞核中转录生成mRNA,在胞质中合成蛋白质;

⑷ 初级转录产物— 核不均一RNA(hnRNA)— 需转录后加工和修饰;

5´端加“帽”、3´端加“尾”、切除内含子、连接外含子,才能形成成熟的mRNA分子;

⑸ 不存在超基因式操纵子结构;

真核生物基因转录产物为单顺反子,一条 mRNA只翻译一种蛋白质。

功能相关的基因大多分散在不同的染色体上,分别进行转录;

⑹ 部分基因多拷贝:既可满足细胞的需要,也是表达调控的一种有效方式。 真核基因表达调控的特征:

⑴ 顺式作用元件是决定真核基因转录活性的关键因素之一

启动子是RNA聚合酶结合并启动基因转录的特异DNA序列;

增强子决定基因的时空特异性表达;

沉默子阻遏基因转录;

⑵ 反式作用因子和顺式作用蛋白是真核基因的转录调节蛋白

⑶ 正性调节占主导的真核基因表达调控机制更加复杂

不同的DNA元件组合可产生多种类型的转录调节方式;

多种转录因子又可结合相同或不同的DNA元件;

转录因子与DNA元件结合后,对转录激活过程所产生的效果各异,有正性调节或负性调节之分。 真核生物转录后水平的调控:

7⑴ 5´端加“帽”——在5´端加上7-甲基鸟苷(mGPPPmNp—);

保护mRNA免遭核糖核酸酶降解,增强mRNA的稳定性;

协助mRNA的剪接;

利于mRNA自细胞核转运至细胞质;

促进mRNA与核糖体的结合,启动翻译。

3´端加“尾”——在3´端加上50-150个A,即多聚腺苷酸尾poly(A);

保护mRNA免遭核糖核酸酶过早降解,有助于保持翻译模板活性。

⑵ mRNA前体的剪接

真核细胞基因表达所转录出的mRNA前体在剪接酶作用下,有序删除每一个内含子并将外显子拼接 起来,形成成熟的mRNA。

⑶ mRNA前体的选择性剪接

选择性剪接(alternative splicing)指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位

点组合)产生不同的mRNA剪接异构体的过程,而最终的蛋白产物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性,或者,在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致不同的表型。

在高等生物细胞的高度异质性中起重要作用。由于剪接的多样化,一个基因在转录后通过mRNA前体的剪接加工而产生两个或更多的蛋白质。

⑷ RNA编辑可增加mRNA信息的内涵。

RNA 编辑(editing)是指基因转录产生的初级mRNA分子中,由于核苷酸的缺失,插入或替换,使mRNA的序列与基因编码序列不完全对应,导致一个基因可以产生多种氨基酸序列不同、功能不同的蛋白质分子。

⑸ 调解成熟mRNA的核外输出影响基因表达。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)指由双链RNA(dsRNA)诱发的同源RNA特异性降解而使基因沉默的过程。

RNA干扰基因沉默的主要靶标:是基因的转录本(transcript)—mRNA。

RNA干扰的机制:

⑴ 双链RNA与Dicer酶复合物(核酸内切酶和解旋酶)结合,激活Dicer酶复合物,并被核酸内切酶切割成21-23bp的双链小RNA(siRNA);

⑵ siRNA与Dicer酶复合物结合,形成RNA诱导的沉默复合物(RISC);解旋酶使双链siRNA成单链; ⑶ 单链的siRNA与靶mRNA互补结合;沉默复合物(RISC)中的Dicer酶复合物的核酸内切酶识别并降解靶mRNA。同时也会形成更多的RISC。

RNAi干扰技术的应用:

⑴ 基因治疗:

RNAi作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因,但又不影响正常的等位基因。

⑵ 肿瘤的基因治疗:

RNAi利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性,设计针对这一序列的dsRNA分子,只导入一种dsRNA 既可以产生多个基因同时沉默。

⑶ 研究基因的功能:

由于RNAi可以特异性抑制特定的基因,获得功能丧失,因此可用于功能基因组的研究。

⑷ 防御病毒的感染:

RNAi具有对抗侵入性遗传因子(如病毒、转座子、转基因)的作用、打破其复制循环、减弱或消除其基因毒性作用。由于RNAi也存在于哺乳动物细胞中,RNAi或许可被利用来治疗病毒性疾病。 反义RNA(antisense RNA)能与特定mRNA互补配对的RNA片段,由反义基因转录而来,天然的具有功能的反义RNA分子一般在200bp以下,反义RNA又称mRNA干扰性互补RNA(mic RNA)。

反义RNA的来源:

① 细胞的反向转录的产物,即产生mRNA和反义RNA的DNA是同一区段的互补链;

② 细胞不同基因的RNA产物;

③ 根据特定基因序列,人工设计构建反义RNA序列。

反义RNA的作用机制:

反义RNA与mRNA互补后,在空间结构上妨碍了mRNA作为模板的蛋白质合成。

⑴ 与mRNA5´端非翻译区包括SD序列相结合,直接抑制翻译;

⑵ 与mRNA5´端编码区起始密码子AUG结合,抑制mRNA翻译起始;

⑶ 与mRNA的非编码区互补结合,使mRNA构象改变,影响其与核糖体结合,间接抑制mRNA翻译。 反义RNA的应用:① 研究基因的功能;② 基因治疗的一种手段。

癌基因(oncogene)指存在于细胞内或病毒颗粒内、其编码产物蛋白质具有增加癌源性或转化潜能导致细胞恶性转化的基因。包括病毒癌基因和细胞癌基因。

病毒癌基因(viral oncogene,v-onc)指存在于致瘤病毒(多为逆转录病毒)基因组中的能在体内诱发肿瘤,在体外引起细胞转化的基因。

细胞癌基因(cellular oncogene,c-onc)指存在于细胞基因组中、正常情况下处于静止或低水平(限制性)表达状态,对维持细胞正常功能具有重要作用,当受到致癌因素作用被活化而导致细胞恶变的基因,又称原癌基因(protooncogene,pro-onc)。

病毒癌基因起源于细胞癌基因

原癌基因活化的分子机制:

⑴ 原癌基因点突变或缺失;

一些原癌基因5’上游存在负调控序列,该序列的缺失或突变,则丧失抑制癌基因表达的能力。

⑵ 原癌基因获得增强子与启动子;

前病毒插入到原癌基因邻近位置,使其获得强启动子和增强子,导致原癌基因过度表达。

⑶ 原癌基因甲基化程度低;

DNA甲基化对于维持双螺旋结构的稳定,阻抑基因转录具有重要作用。甲基化程度下降,基因表达增强。 ⑷ 原癌基因扩增;

由于原癌基因复制出多个拷贝,直接增加可用的转录模板数以增加基因表达。

⑸ 原癌基因重排与染色体易位;

原癌基因从所在染色体上的正常位置易位到另一染色体上的某一位置,使调控环境发生改变,使之从相对静止状态转变为激活状态。

抑癌基因(tumor suppressor gene / antitumor gene)指一类抑制细胞过度生长、增殖,从而遏制肿瘤形成的基因。又称肿瘤抑制基因。 Rb P53

DNA序列分析——Sanger-双脱氧末端终止法原理

在DNA聚合酶的催化下,2´, 3´-ddNTP通过其5´-P基团参入到延伸的DNA链中,由于ddNTP没有 3´-OH端,不能与与后续dNTP的5´-P端形成3´, 5´-磷酸二酯键,导致DNA链的延伸终止于ddNTP。 在DNA合成反应混合物的4种dNTP中加入少量的一种ddNTP,链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP,结果将产生4组寡核苷酸,他们将分别终止于模板链的A、G、C或T位置。

核酸分子杂交 具有一定同源序列的两条核酸单链(DNA或RNA)在适宜条件下按碱基互补配对原则经过 复性处理后,形成异源双链的过程。

核酸分子杂交原理:

根据DNA变性与复性的原理,使不同的单链DNA与单链DNA,或与单链DNA与RNA或RNA与RNA形成双链分子的过程。

(在核酸分子杂交过程中,来源不同、具有互补碱基序列的核酸(DNA或RNA)单链在适宜条件下可按碱基配对规则通过氢键结合在一起形成双链结构,选用已知顺序核酸片段作为探针,经放射性同位素或非放射性物质标记后,再与未知的目的核酸链进行杂交反应,分离已杂交和未杂交的标记核酸片段,通过标记信号的检测就可以对未知的目的核酸进行定性、定量分析。)

核酸分子杂交类型:

⑴ 根据杂交本质: DNA与DNA杂交、DNA与RNA杂交、RNA与RNA杂交

⑵ 根据标记的探针:放射性核素杂交、非放射性核素杂交

⑶ 根据杂交形式:点杂交和狭缝杂交液相杂交、固相杂交、原位杂交(细胞和组织原位杂交)、 荧光原位杂交(FISH)、DNA点阵、基因芯片等。

核酸分子杂交步骤/基本过程:

① 标记一段核苷酸片段(通常是DNA片段)作为杂交的探针。

② 琼脂糖凝胶电泳分离待杂交的核酸片段。

③ 将凝胶中的核酸片段碱变性,并转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。

④ 将膜上的核酸片段固定(80℃,0.5~2小时)和变性。

⑤ 把膜和标记的探针放入杂交袋内进行预杂交(洗膜)、杂交和洗膜。

⑥ 检测杂交结果与分析。

核酸分子杂交方法:

多采用固相-液相杂交:把核酸样本或探针先结合到固相载体上,与液相中的探针或核酸样品杂交。 ⑴ 斑点杂交:DNA(RNA)变性→点在硝酸纤维素膜上→把含有DNA的硝酸纤维素膜上放入杂交袋内,与探针进行杂交。

用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究。

⑵ DNA点阵:将未标记的探针按序点在硝酸纤维素膜上→把含有探针的硝酸纤维素膜上放入杂交袋内, 与标记的核酸样品进行杂交。

⑶ 基因芯片:将未标记的探针按序点在硅片上→把含有探针的硅片放入杂交袋内,与标记的核酸样品 进行杂交。基因表达高通量分析法。

⑷ 细胞原位杂交:将细胞在硝酸纤维素膜上裂解、DNA变性→把硝酸纤维素膜上放入含有探针的杂交袋内,进行杂交。

⑸ 组织切片原位杂交:将组织切片的DNA变性→把组织切片放入含有探针的杂交袋内,进行杂交。 原位分子杂交技术用于基因及其表达产物的定位分析。

核酸分子杂交应用:

① 基因表达的检测;② 鉴定DNA重组体;③ 鉴定基因突变;④ 基因定位;⑤ 新基因的发现; ⑥ 检测核酸序列相似性;⑦ 药物筛选;⑧ 细胞遗传学分析;⑨ 基因诊断。

核酸探针 是一段与被检测的核酸序列互补的带有标记的核苷酸片段。如DNA探针(常用寡核苷酸探针)。 转移印迹技术 是指将凝胶上的DNA或RNA或蛋白区带转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上,成为固定化分子的过程。

转移印迹类型:

① Southern印迹(Southern blot)

将电泳分离的待测DNA片段(酶切消化后)转印到NC膜上,与存在于液相中标记的核酸探针进 行杂交的过程。

用于分析基因拷贝数的变化。

② Northern印迹(Northern blot)

将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上,定性分析mRNA的常用方法。

用于分析基因转录水平的变化 。

③ Western blot(蛋白免疫印迹)

将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中转印到PVDF膜上,利用特异性抗体进行反应,定性分析蛋白质。 用于分析基因表达(蛋白水平)的变化。

基因芯片(gene chip):是根据核酸分子杂交的原理,将大量探针分子固定在支持物上,然后与标记的被检样品杂交,并对杂交信号的强度与分布进行分析。又称DNA芯片或DNA微阵列。

聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)指在体外以DNA为模板,在DNA引物存在的条件下,由DNA聚合酶催化底物合成DNA的过程。即指体外的DNA扩增过程。

PCR的原理

依据细胞内DNA半保留复制的机理,以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质,人为地控制体外合成系统的温度,以促使双链DNA变成单链,单链DNA与人工合成的引物退火,然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成,即高温变性、低温退火、中温延伸3个步骤构成PCR反应的一个循环,此循环反复进行,使目的基因得以迅速扩增。

PCR引物设计须遵循的原则——单链寡核苷酸DNA片段

① 引物长度:18~30个碱基。过长容易形成发夹结构、提高退火温度、增加成本;过短造成非特异扩增。 ② 避免两引物间产生二聚体(互补)。

③ 避免出现相同碱基的堆积。

④ G+C的量在45%-55%为宜。

⑤ 3´端避免重复的CG序列,以免产生错配。

⑥ 两条引物的Tm值相差不要过大。Tm=2(A+T)+4(C+G)。

⑦ 根据实验需要可在引物5´端加入修饰成分,如酶切位点、标记物、突变碱基、启动子序列等。 ⑧ 最好用软件分析。

PCR反应体系:

⑴ 模板DNA

⑵ DNA引物:需一对特异的引物,为化学合成的寡核苷酸(DNA片段);(目的DNA两侧的序列需已知) ⑶ 底物(dNTP):四种浓度相同的dNTP ,20-200µmol/L,否则增加错配的几率。

⑷ Taq DNA聚合酶(耐热)

⑸ Tris-HCl缓冲液(pH8.4)

⑹ Mg2+:Taq DNA聚合酶的激活剂

PCR的基本反应步骤:

① 变性(denaturation)经加热使模板DNA从dsDNA 变成ssDNA;95℃

② 退火(annealing)引物与单链DNA杂交;Tm-5 ℃

③ 延伸(extension)耐热DNA聚合酶催化子链DNA的合成。72 ℃

循环次数:20~40次

PCR产物的检测:

⑴ 琼脂糖凝胶电泳:判定扩增产物的有效性与正确性;

⑵ 区带扫描:定量分析;

⑶ 序列分析:与目标序列一致否或是否有突变。

逆转录PCR(RT-PCR)指先以RNA为模板,在逆转录酶催化下生成cDNA,并以之为模板进行PCR合成双链DNA的过程。

① 提取细胞总RNA;② 逆转录成cDNA;③ PCR:以cDNA为模板进行特定基因的PCR扩增。 RT-PCR是目前从细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。

实时定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)指在PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对样品中的DNA的起始浓度进行定量分析的方法。

用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。

PCR在基因分析中的用途:

⑴ 常规PCR:获取目的基因、合成寡核苷酸探针、诱导定点突变、鉴定重组DNA。

⑵ RT-PCR:获得cDNA、合成cDNA探针、基因表达、检测RNA病毒。

⑶ 原位PCR:肿瘤发生学、胚胎学、功能基因组学、病毒学研究。

⑷ 差异显示PCR:研究基因表达的差异,以了解细胞分化、增生、细胞周期的调节、细胞衰老与凋亡、肿瘤及多种疾病的分子遗传学。

⑸ PCR-RFLP技术、PCR-ASO技术、PCR-SSCP技术:基因突变分析(点突变)。

⑹ 定量PCR:基因表达、病原体检测。

⑺ 基因诊断。

基因工程(gene engineering)指在体外对DNA分子按照规定的目的和方案,对DNA进行剪切和重新连接,然后把它导入宿主细胞,从而扩增有关DNA片段,表达有关基因产物,进行DNA序列分析、基因治疗、研究基因表达的调节因子及基因的功能。

基因重组 进入宿主细胞内的DNA通过某种机制整合到宿主细胞DNA上去,或人工将两个DNA片段连接在一起,这种过程称为基因重组。

分子克隆(或DNA克隆、基因克隆) 指来自于同一始祖DNA的相同副本或拷贝的集合。

重组DNA技术 是在体外按人们的意愿将不同的DNA分子组合成新的DNA分子的技术。

重组DNA技术的应用:

⑴ 疾病基因的发现与克隆

⑵ 生物制药

⑶ 基因诊断--DNA诊断

⑷ 基因治疗

⑸ 遗传病的预防:产前诊断、携带者检查、症候前诊断、遗传病易感性检查。

基因克隆中常用工具酶:

⑴ 限制性内切核酸酶,识别特异序列,切割DNA。

⑵ DNA聚合酶Ⅰ,有聚合酶活性、5´-3´外切酶活性、3´-5´外切酶活性。

⑶ DNA聚合酶Ⅰ大片段,即klenow片段

有5´-3´聚合酶活性和3´-5´外切酶活性,无5´-3´核酸外切酶活性;

合成双链cDNA 的第二条链、填补双链DNA3´末端、切口平移制作探针、DNA序列分析。

⑷ 逆转录酶(reverse transcription)一种依赖RNA的DNA聚合酶;即以RNA为模板合成DNA,合成方向为5´→3´延伸,无3´-5´外切酶活性;

以mRNA为模板合成cDNA,构建cDNA文库。

⑸ T4DNA连接酶

催化双链DNA的3´-OH端和另一双链DNA的5´-磷酸根,形成磷酸二酯键,连接DNA片段。 ⑹ 碱性磷酸酶

切除DNA的5´端磷酸基,防止载体自身连接。

⑺ 末端脱氧核苷酸转移酶

催化脱氧核苷酸转移到DNA的3´-OH加同质多聚物,主要用于探针标记。

限制性内切核酸酶Ⅱ型(restriction enzyme) 能识别特异的DNA序列,并在识别序列内进行切割(裂解磷酸二酯键),产生特异DNA片段的核酸水解酶。基因工程中使用的内切酶即指Ⅱ型。

限制性内切核酸酶的识别和切割位点:

通常是4-6个bp,具有回文结构的DNA序列,多数限制性内切酶是错位切割双链DNA,产生5´或3´

粘性末端(sticky end)。

限制性内切核酸酶的用途:

⑴ 基因克隆

⑵ DNA基因组的物理图谱的建立

⑶ 基因的定位和分离

⑷ DNA分子碱基序列分析

⑸ 比较相关的DNA分子和遗传工程

基因克隆的操作步骤:

⑴ 目的基因的分离获取;

⑵ 载体的选择或构建;

⑶ 目的基因与载体连接;

⑷ 重组体导入受体菌或细胞;

⑸ 筛选和鉴定含重组DNA分子的受体菌或细胞;

⑹ 目的基因的表达鉴定及产物纯化。

获取目的基因的方法:

⑴ 聚合酶链反应(PCR)

⑵ RT-PCR合成双链cDNA

⑶ cDNA文库或基因组文库

⑷ 人工合成

基因载体 指携带目的DNA片段进入受体细胞进行扩增或表达的双链环状的DNA分子。

⑴ 克隆载体(cloning vector)指携带外源DNA进入受体细胞,使之在受体细胞内复制扩增的基因载体。 ⑵ 表达载体(expressing vector)指为使外源基因表达产生蛋白质而特殊设计的基因载体。

常用的基因载体:质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、黏粒、病毒、细菌人工染色体、酵母人工染色体。 克隆载体应具备的条件:

⑴ 载体都能携带外源DNA片段进入受体细胞,或停留在细胞质中自我复制,或整合到染色体DNA上,随着染色体的复制而同步复制;

⑵ 载体都具有合适的遗传标记;

⑶ 载体都具有供外源基因插入的限制性内切酶位点;

⑷ 载体必须安全,不应含有对受体细胞有害的基因,并不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞; ⑸ 载体本身分子量较小,容纳较大的外源基因片段;

⑹ 载体在细胞内的拷贝数要高,方便外源基因在细胞内大量扩增;

⑺ 载体在细胞内稳定性要高,保证重组体稳定传代不易丢失;

⑻ 载体的特性是充分是充分掌握的,包括其全部的核苷酸序列。

克隆载体的分类:

⑴ 质粒

⑵ λ噬菌体:插入型载体λgt10和λgt11用于建立cDNA文库,能克隆7kb以下的外源DNA。 ⑶ 黏性质粒:由λ噬菌体的粘性末端、与质粒重新构建的载体,双链、环状DNA。

用于构建基因组DNA文库,具有较高的转导性。

⑷ M13噬菌体

⑸ 病毒载体:逆转录病毒、腺病毒、EB病毒。

质粒(plasmid)是指存在于细菌染色体外的具有复制能力的双链环状DNA分子。

质粒作为克隆载体应具备的特征:

⑴ 质粒的分子量相对较小,能在细菌内稳定存在,有较高的拷贝数;

⑵ 质粒具有一个以上的遗传标志,便于筛选阳性克隆;

⑶ 质粒具有多个限制性内切核酸酶的单一识别序列,便于外源基因的插入位点。

松驰型质粒(relaxed plasmid)分子量小,属于高拷贝质粒(每个细菌内可多达10-200个);细菌对其复制是松驰的;是基因工程中常用的质粒。

克隆质粒 能够与外源DNA片段在体外连接,构成重组分子,在被导入宿主细胞后能在细胞内进行自我复制的质粒。用于克隆和扩增特定的DNA片段。

转染(transfection)指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获取新的表型的过程。 将外源性DNA引入真核细胞的方法/真核细胞转染的方法:

⑴ 磷酸钙共沉淀法

重组DNA与CaCl2溶液混合形成DNA-磷酸钙微颗粒,颗粒沉积到受体细胞表面可被摄取。 ⑵ 电脉冲法(电穿孔)

重组DNA与受体细胞混合,加上高频电流使细胞出现小孔,使DNA进入细胞。

⑶ DEAE-葡聚糖法

重组DNA与带有大量负电荷的DEAE-葡聚糖混合形成复合物,黏附在细胞表面而被细胞内吞。 ⑷ 脂质体融合法

重组DNA与阳离子脂质体混合形成稳定的质脂双层复合物,与受体细胞混合后可以融合。

⑸ 显微注射法

利用显微注射仪,通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核。

⑹ 基因枪法

是利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时,能将包裹在金属颗粒表面的外源DNA随之带入细胞。 ⑺ 激光微束穿孔转化法

利用直径很小,能量很高的激光微束能引起细胞膜可逆性穿孔的原理,使处于细胞周围的外源DNA进入细胞。

⑻ 超声波介导转化法

利用低音强脉冲超声波的物理作用,可逆性地击穿细胞膜并形成过膜通道,使外源DNA进入细胞。 阳性克隆的筛选和鉴定:

⑴ 遗传标志筛选法

抗药性标志筛选,载体带有抗生素抗性基因(如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素);

标志补救筛选

抗生素抗性基因插入失活筛选

α-互补筛选(蓝-白筛选)

⑵ 序列特异性筛选法

限制性内切酶法,根据限制酶切图谱筛选特定DNA。

核酸杂交法——菌落原位杂交、Southern印迹杂交,常用于从文库中筛选目的DNA。

PCR法,利用序列特异性引物,经PCR进行扩增,通过琼脂糖凝胶电泳,直接鉴定目的DNA的存在。 DNA测序法,是最准确的鉴定目的DNA的方法。

⑶ 亲和筛选法,借助相关表达产物而筛选阳性克隆。

α-互补 载体携带β-半乳糖苷酶N端(α片段)的编码序列,在该序列中含有多克隆位点;宿主菌含有β-半乳糖苷酶C端(ω片段)的编码序列。只有当载体与宿主菌同时共表达该酶的α和ω片段时,才能形成有活性的β-半乳糖苷酶,该现象称为α-互补。

α-互补筛选(蓝-白筛选)利用了β-半乳糖苷酶功能互补的基因片段。β-半乳糖苷酶在诱导剂IPTG存在的情况下,使底物X-gal转变为蓝色产物,使菌落或噬斑呈蓝色。当外源DNA片段插入载体的多克隆位点后,便不能表达α片段,转化细菌后不能分解底物,结果使菌落或噬斑呈现白色。

原核表达载体(prokaryotic expression vector)

⑴ 复制起始点;

⑵ 多克隆位点;

⑶ 抗生素抗性基因;

⑷ 启动子(P)是启动外源基因表达的必需元件,能被RNA聚合酶所识别;

⑸ 核糖体结合位点(SD序列)保证了翻译起始复合物的形成;

⑹ 转录终止子(TT)有助于外源基因的高效表达。

真核表达载体(eukaryotic expression vector)

⑴ E.coli的复制起始点;OriPro

⑵ 多克隆位点;

⑶ 质粒的抗生素抗性基因;

⑷ 真核细胞复制起始序列;Orieuk

⑸ 真核表达调控元件(启动子、增强子、多克隆位点MCS、转录终止序列、poly A 加尾信号); ⑹ 真核细胞药物抗性基因。

基因表达的分析方法:

基因表达的定性或定量分析包括在mRNA水平和蛋白质水平上的检测。

⑴ RNA水平检测:

① Northern blot,Northern印迹用于分析基因转录水平的变化。

② RT-PCR,半定量分析基因表达;

③ 实时RT-PCR(荧光定量PCR),是目前在mRNA上定量分析基因表达最灵敏的方法。

④ RNA酶保护试验,分析转录后RNA剪接;

⑤ DNA芯片/DNA微阵列,同时进行高通量基因转录活性的分析。

⑵ 蛋白质水平检测:

① Western blot(蛋白免疫印迹),利用特异性抗体,定性分析基因表达(蛋白水平)的变化。

② 流式细胞术(FCM),利用荧光标记的抗体与活细胞表面或细胞内的蛋白质结合,经流式细胞仪检测

分析荧光信号,对基因的表达活性作出判断。

③ 免疫组织化学,利用显色剂标记的特异性抗体在组织或细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学显色

检测特定的抗原(蛋白质),从而对抗原进行定位、定性和定量分析。

④ 酶联免疫吸附实验;

⑤ 免疫荧光。

⑶ 功能水平检测:Enzyme activity、Binding activity。

基因诊断(gene diagnosis) 指利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法,直接检测基因结构(DNA诊断)及其表达水平mRNA(RNA诊断)是否正常,从而对疾病作出诊断。

目标分子主要是DNA,可分为定性和定量分析。

适用于遗传病、感染性疾病和肿瘤性疾病等。

基因诊断的技术和方法:

⑴ 限制性片段长度多态性(RFLP)技术

⑵ 核酸分子杂交技术

⑶ 聚合酶链反应(PCR)

⑷ DNA多态性分析

⑸ 基因芯片

⑹ 蛋白质芯片

⑺ DNA序列测定

基因诊断的医学应用:

⑴ 遗传病的筛查与诊断(包括产前筛查诊断、胚胎植入前的遗传检查等)

⑵ 感染性疾病的诊断(确定感染的病原体)

⑶ 多基因常见病的预测性诊断(即肿瘤基因诊断)

⑷ 某些病原微生物的分型

⑸ 组织器官移植的配型

⑹ 法医学的个体识别(DNA指纹)(排查犯罪嫌疑人、亲缘关系鉴定等)

⑺ 疗效评价和用药指导

基因治疗(gene therapy)指利用基因转移和重组技术,将正常的目的基因导入患者细胞内,用以纠正或代替其异常基因的功能,达到治疗疾病的目的。

基因治疗的基本策略和方法:

1.直接策略:针对治病基因的基因治疗。

⑴ 直接将治疗基因载体转移到靶细胞内。

⑵ 在体外,先将治疗基因载体转移到合适的受体细胞内后培养增殖,再回输给患者。主要方式 基因治疗方法:

① 基因矫正:纠正致病基因的突变碱基;

② 基因置换:通过同源重组(基因打靶技术)将正常基因定点整合到靶细胞基因组上,以原位替换致 病基因。

③ 基因添加:不去除异常基因,将正常基因导入病变细胞(或正常细胞)后发生非定点整合,以补偿缺陷基因的功能或增强原有基因的功能。目前基因治疗常用的一种方式。

④ 基因干预:采用特定的方法抑制异常基因表达,或破坏异常基因结构使之不表达。

反义RNA技术、RNA干扰技术、三链DNA技术、核酶技术用于基因治疗。

2.间接策略:不直接针对致病基因的基因治疗。

基因治疗方法:

① 免疫性治疗基因,如导入IL-2、干扰素、TNF基因,增强抗肿瘤效应。

② 化疗保护性基因,如导入编码抗细胞毒物蛋白基因,提高机体对化疗药物耐受力。

③ 自杀基因:将某些病毒或细菌的基因导入靶细胞中,其表达的酶可催化无毒的药物前体转变为胞毒性物质,从而杀死肿瘤细胞。如tk-GCV系统。

基因治疗的基本程序:

⑴ 治疗基因的选择;

⑵ 靶细胞的选择(造血干细胞、皮肤成纤维细胞、肌细胞、血管内皮细胞、肿瘤细胞等); ⑶ 载体的选择(病毒载体系统和非病毒载体系统);

⑷ 用载体将治疗基因导入受体细胞(包括构建DNA重组体、筛选与鉴定);

⑸ 阳性克隆细胞的大量培养;

⑹ 回输患者体内。

基因治疗的基本条件:

⑴ 对导入的基因及其产物有详尽的了解;

⑵ 外来基因能有效的导入靶细胞;

⑶ 导入基因能在靶细胞中长期稳定存在;

⑷ 导入基因能有适度水平的表达;

⑸ 基因导入的方法及所用的载体对宿主细胞安全无害。

2011级 研究生院4班 董建华

范文四:分子生物学和医学

分子生物学的兴起是整个自然科学的一件大事,它使整个生命科学的研究上升到一个全新的阶段。在实际应用方面,它是生物工程技术的重要理论基础,后者正在工农业生产和环境保护等方面发挥着日益显要的作用。医学做为生命科学的重要组成部分,所受分子生物学的渗透和影响尤其重大。

(一).分子生物学使整个医学科学研究提高到分子水平

经典的生物学只能从生物表型的变化描述和归纳生命活动的某些规律,所谓基因也还只是抽象的概念,表型的分子基础也未查明。从前的医学研究状况大体上也是如此。只有分子生物学的研究才使医学各科上升到基因水平、分子水平,从而出现了所谓分子微生物学、分子免疫学、分子生理学、分子病理学、分子药理学、分子心脏病学、分子神经病学、分子内分泌学等等全新的领域。不仅理论研究如此,在临床实践上,基因诊断和基因治疗,也提到日程上来了,有些诊断方法正在付诸实施,有些则正在积极探索。

(二).癌症的研究即将出现重大的突破

癌基因的发现是近年来分子生物学研究的重大成果。过去在癌病因学上众说不一的局面正在改善。由各种内外因素导致癌基因激活或异常表达很可能就是癌症发生的根本原因。癌基因本来是正常的基因成分之一,它的生理功能是什么?它是如何被调控的?异常表达和激活的机理是什么?癌基因产物和生长因子的关系是怎样的?是否存在着反癌基因和生长的负调节因子?等等。这些问题都是当前研究的热点,正在取得日新月异的进展,与此有关的是爱滋病(AIDS)的研究受到世界范围的密切关注,这个问题从学术上讲,主要属于分子免疫学和分子病毒学的范畴、其发病的分子机理正在被逐步深入地阐明。如果分子生物学研究成果和社会性的预防措施能够很好地结合起来,这个疾病的流行将会较快得到制止。

(三).遗传病

随着医学分子生物学研究的日益深入,有关遗传病的一些概念正在发生变化。首先,这类疾病不再象过去认为的那么罕见。至今发现按照孟德尔方式遗传的遗传病已达3000余种。如果估计到疾病易感性和基因变异的关系,则遗传病范围会更加扩大,例如易患心脏病、肺气肿、高胆固醇血症、糖尿病、变态反应和胃溃疡病等等的基因正在得到分离,甚至癌症,有的学者认为也可归属于遗传病的范畴,其根本原因在于DNA的损伤。其次,基因探针技术正在逐步扩大产前诊断和遗传病诊断的范围。显然,检查出易感某病的基因对于个人保健是十分宝贵的信息,也是针对疾病危险因素采取预防措施的科学依

据。在治疗上,过去一切对遗传病的疗法都只能是对症的,从理论上讲,只有基因疗法才是治疗遗传病的唯一根治方法。当然,要将这种方法付诸实践在当前尚有许多理论上和技术上的困难有待克服。

(四). 药物和疫苗

随着基因工程的蓬勃兴起而首先受益的产业领域就是制药工业。现在已经有些多肽或蛋白质药物,如人胰岛素、生长激素、干扰素等能够通过“工程菌”大量生产,更多的药物则正在开发之中。疫苗的研制正在极大地促进预防医学的发展,例如,乙型肝炎疫苗、非甲非乙肝炎疫苗、轮状病毒疫苗、疟疾疫苗等等,有些已能付诸应用,有些尚在开发之中。通过蛋白质工程技术,采用定点突变的方法,还可望制造出新型的蛋白质。例如,白细胞介素 2和β干扰素是两种具有抗癌作用的蛋白质,在其多肽链中各有三个半胱氨酸残基,但只形成一对二硫键,由于分子中含有多余的一个半胱氨酸残基,所以二个分子容易缔结合成二聚体而失活,用定点突变法改变半胱氨酸的密码子为丝氨酸密码子,就可防止二聚体的形成,从而在不损害活性的情况下大大延长这两个蛋白质的半衰期,提高了疗效。

该文章转载自医学全在线:http://www.med126.com/edu/200712/18854.shtml

范文五:生物医学光子学

生物医学光子学 运用光子学原理和技术,为医学、生物学和生物技术领域中的问题提供解决方案即构成生物医学光子学的研究内容。生物医学光子学涉及对生物材料的成像、探测和操纵。在生物学领域,主要研究分子水平的机理,监测分子结构与功能,在医学领域,主要研究生物组织结构与功能,能对生物体以非侵入的方式,实现宏观与微观尺度分子水平的疾病探测、诊断和治疗。目前,生物医学光子学主要包含以下研究内容:一是生物系统中产生的光子及其反映的生命过程,以及这种光子在生物学研究、医学诊断、农业、环境、甚至食品品质检查方面的重要应用。利用光子及其技术对生物系统进行的检测、治疗、加工和改造等也是一项重要的任务。二是医学光子学基础和技术,包括组织光学、医学光谱技术、医学成像术、新颖的激光诊断和激光医疗机理极其作用机理的研究。

这里我主要介绍的是生物医学光子学在医学上的应用。

1.生物医学光子学的发展与战略地位

生物医学光子学的内涵生物学或生命科学是光子学的一个重要应用领域。生物学研究与医学研究、诊断和治疗涉及到的光学及其相关的应用技术,包括其中最基础性的光物理问题,均可列为生物医学光子学的研究对象。

一般认为,光学领域未来发展的重点是将各种复杂的光学系统和技术更加广泛地应用于保健和医疗。当今世界中,与光学有关的技术冲击着人类健康领域,正在改变着药物疗法和常规手术的实施手段,并为医疗诊断提供了新方法, 为生物学研究提供了新的手段,还开辟了在细胞内进行高度定位的光化学疗法。 越来越多的事实说明人们对采用生物医学光子学技术解决长期困扰人类的疑难顽疾如心血管疾病和癌症所起的作用寄予很大希望,其中的重大突破将起到类似X射线和CT技术在人类文明进步史上的重要推动作用,在知识经济崛起的时代还可能产生和带动一批高新技术产

2.生物医学光子学有关医学的的主要内容

(1)生物物组织中的传输理论;

当前组织光学统一的理论架构体系尚未建立,生物组织的光学理论远未成

熟。需要有更精细和准确的理论来替代现有过于简化的模型,也就是要用更复杂的理论来描述生物组织的光学性质以及光在其中的传播行为。此外,发展生物组织中光传输的数值模拟也是一个研究方向。应根据生物组织的多样性和复杂性要求,除了把注意力放在开发新的更为有效的具体算法上外,还应把蒙特卡罗方法作为工具,具体应用到实际的组织光学模型上,通过计算给出关于光在生物组织中传输的新知识。除了了解光在组织中的分布与其光学性质基本参量之间的确定的经验关系,为无损光活检或光诊断开辟一条新的途径。

·活体组织光学参数的测量方法与技术实际应用中真正需要的是人体活体组织的光学特性。凡是与基本参数有关的关系或规律,都可以成为测量的依据和原理,因而涉及到的内容几乎是包罗万象的。比如,发人深思的研究内容含盖时间分辨、频率调制、相干、散斑与逆求解技术,这些方法都可以用来测量和刻画组织的主要光学性质(吸收和散射因素)。新的手段还有相干背散射、超快时间分辨谱与空间分辨谱、光谱动力学、全息术、干涉和相干非线性光学效应、脉冲与相位调制术、甚至神经网络技术等等。

·反射光谱学的理论与技术漫散射光谱技术作为一种无创检测方法已在血氧监测方面得到成功的应用。理论依据是:由于在近红外光谱区生物组织具有低吸收强散射的特性,因此近红外光能够达到组织部一定深度,部分光被吸收,其余被散射回到组织表面,即为漫反射。根据漫反射率与生物组织光学参数的关系,从测量数据中计算出吸收系数和有效散射系数等组织的光学参数,并且可以利用它们的数值的变化计算影响组织光性质的分析物的浓度变化。将漫散射光谱技术应用于“组织光学参数测量”,或无创血糖和其他体液的检测,还有许多理论和实验研究工作需要完成。

·生物组织的光热响应有关光与辐照组织光热响应理论目前尚处于初级阶段,已提出的模型和公式仅能粗糙地估算组织吸收光能量后的热响应和过量辐照造成的热损伤。这是任何光治疗和光诊断涉及的最基础的问题之一。

因为组织对光辐射的热响应与激光光源特性密切相关,在宽广的光谱范围内连续或脉冲光均表现出不同的组织吸收、散射行为和不同的穿透深度,进而反映出组织体内不同的温度响应及其热分布特征。人体组织是一种十分复杂且多样化的介质,激光辐射产生的各种光热现象与组织固有的生理属性是互为依赖。

有需要针对每一种特定的光诊断或是光治疗研究其激光辐照下热响应的生物物理现象及其内在生物作用机理,确定个体靶对象的特定波长光剂量,以期达到预定的医学效果,又避免热致损害。这是目前新建一项光医疗技术不可或缺的基础性工作。

(2)医学临床(前)诊断技术 主要包括荧光测量与成像技术;散射成像;光谱测量与成像技术;时间与偏振分辨成像技术;超声调制的光学成像技术。 (3) 医学临床治疗技术(激光医学)

光动力疗法;激光内窥镜手术;激光心血管病学;光子中医学的探索;激光美容嫩肤术;激光外科学;激光运动医学;新型激光器械、光学传感器与新技术在各临床学科的应用。

*生物组织超声调制的光成像方法与技术利用超声场在生物组织中的优良传输特性和激光在生物组织中的选择性吸收特性,将超声定位技术和光学高灵敏度检测技术结合,以实现无损伤临床医学的结构和功能层析诊断技术。采用高灵敏度光子学检测技术和实时快速傅里叶变换技术,最终将提供一种适合临床医学影像诊断的聚焦超声调制光学层析成像方法,为临床医学上小于1mm线度的早期癌组织诊断、无损伤医学活检和组织代谢功能识别做理论和技术上的准备。预期成像深度远好于目前的光学成像方法,对于较厚生物组织成像及临床应用特别具有吸引力,可为及早发现一些特殊病变提供一种无损、有效、高准确度的方法。 *无创伤的血糖测量术目前,糖尿病人需要经常性地采集血样进行化验,这既不方便又不及时,还给病人带来痛苦。因此,新的可靠的无损检测方法一直是人们追求的目标。

已经提出一些诸如在体内埋人电化学传感器和基于光谱光的方法等,但这些方法都不是很成熟。近年,有研究发现,血糖浓度与组织的光散射系数呈一定的相关性。这说明有可能通过无损地测量组织的光学性质参数,间接地得到血糖水平,这就为血糖的光学检测开辟了一个新的途径。这个新方法利用了血糖对光在组织传输行为的影响作用。然而,由于生物组织的复杂性,血糖水平与组织光学性质参数之间的联系并不表现出简单的对应关系。这里面还有许多现象需要研究。

*新颖的光子技术、器件和仪器开发如:研制医用半导体激光系统、角膜成形与血管成形用准分子激光设备、激光美容(换皮去皱、植发)这新近兴起的光子嫩肤保健型设备或其它新激光设备,开拓新工作波段的医用激光系统以及开发高性能的超脉冲CO,,Ho,YAG及Er:YAG激光手术刀等。此外,为了提高靶面上使用的辐照m值,增强作用效果,避免治疗的热灼伤,无论对外科技术的强激光或是美

容嫩肤的弱激光治疗,均要求对治疗面实施直接冷却。此类激光治疗中的冷却技术开发应引起人们的重视。

生物医学光子学被预测将在以下八个领域有所发展:光动力学医疗、激光和组织的相互作用、无透镜显微术、在血液化学分析中的进展、癌症的光学显示、利用激光检测DNA、伤害最小的光子设备、一体化的激光和成像系统。生物医学光子学是一门新兴的交叉科学,它必定将随着激光器、光纤技术、信息科学、生物学、医学、物理学、化学、工程学等各领域的新突破而迅速发展。

范文六:生物医学光子学

关键词:近红外光谱技术、血氧检测、血糖检测、肿瘤检测

正文

1 NIRS概况及医学检测中应用的物理基础

美国试验和材料检测协会将波长在780~2526nm(波数12500~4000𝑐𝑚−1)之间的电磁波称为近红外光谱区(NIRS)。NIR是最早发现的非可见光,介于可见光(VIS)和中红外光(MIR)之间,分为近红外短波(780~1100nm)和近红外长波(1100~2526nm)。 现代NIRS分析技术是分析化学领域发展迅速的高新技术,被誉为分析巨人,引起了众多分析专家的注目。

各种含氢基团在近红外光谱区有独特的光学特性,近红外光谱分析技术利用物质分子在近红外照射时,产生振动能级跃迁,吸收部分光能,主要为含氢基团-OH、-CH、-NH、-SH、-PH等振动倍频和合频的吸收,形成谱带。 通过测量物质对光的吸收情况,得到相应的近红外光谱图,其中包含被测物质的特征。几乎所有有机物的一些主要结构和组成成分都能够在NIRS中找到特征信号,使近红外作为获取物质组成和结构信息的有效载体。 根据检测对象的不同分近红外透射光谱(NIT700~1100nm)和近红外漫反射光谱(NIR1100~2526nm);NIT是利用透射光与入射光强的比例获取光谱,NIR是利用反射光与入射光强的比例获取光谱。由于近红外光子能量比可见光低,对物质的穿透力强,可以对生物体在体无损非侵入分析和检测,生物体不同组织成分对近红外光具有不同的吸收、散射特性,因此近红外光谱对不同组织成分及其变化有较强的区分能力。临床中NIRS广泛用于对血液和人体代谢的分析与疾病诊断等领域,主要集中在血糖、血氧测定、乳腺肿块、尿液成分以及尿路凝结物等的无创检测及相关扩展方面的实验研究。

2近红外光谱技术在血氧检测中的应用

近红外光谱技术无损测量血氧含量的基本机理在于:(1)生物组织对近红外谱段(700nm~900nm)的光表现为高散射和低吸收的特点。在这段波长范围内,光子可以传播到皮肤表面几厘米以下的组织,光学测量的空间范围广。(2)可反映组织功能活动状态的 HbO2 和Hb浓度变化,会引起组织对光的吸收光谱的变

化。这为组织功能活动的研究提供了前提条件。混浊介质人体组织对近红外光的吸收能力远远小于散射作用。700~900nm波段光被称为组织的“光学窗”(Optical Window),表明处于该波长范围内的光易于穿过人体组织。双波长是稳态光谱技术中最常用、最简单的检测方法。通过该方法,利用朗伯-比尔定律,可以测量得到血红蛋白浓度相对变化量和血红蛋白浓度绝对变化量。

图1 手指测脉搏血氧饱和度示意图

例如,在手指上采用近红外光谱技术测脉搏血氧饱和度的方法,利用动脉血液中氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白对红光(660nm)和红外光(940nm)这两个波段上的吸收度的很大差别,采用化学中分光光度技术,朗伯一比尔定律的连续方程求解获得动脉血氧饱和度方程。通过大量自愿者的医学实验结果总结出接收到红光和红外光的交流部分与直流部分的比值与动脉血氧饱和度呈线性关系如(1)式。

Sp𝑂2=110−25𝑅 (1)

式中,𝑎𝑐660和𝑎𝑐940分别代表了红光660nm和红外光940nm在通过生物体时,随光路径上组织血管中血液脉动的变化量;由公式(1)可见,𝑎𝑐660和𝑎𝑐940这两个交流变化量的比值与生物组织氧合状况(血氧饱和度)成正比关系。

其中,R ratio =𝑎𝑐660

/𝑑𝑐660。 940940𝑎𝑐/𝑑𝑐

近年来,组织血氧的定量检测已经取得了很大的进展。但这些算法都是假定组织为均一的、半无限的单层介质。事实上,人体组织除了待测组织如肌肉组织和脑组织等以外,还包括皮肤、皮下脂肪、颅骨等表层介质,而上述的这些方法都没有考虑表层组织,因此由这些方法算出的组织血氧或其变化量只是待测组织的等效量,并非实际组织的血氧含量。近年来,一些学者在研究组织血氧定量检测技术中考虑了表层组织的影响,并试图寻求克服这种影响的方法,以实现真正意义上的定量化检测。

3近红外光谱技术在血糖检测中的应用

近红外光谱技术用于无创人体血糖检测的研究具有强烈的需求。无创血糖检测是一项先进的血糖检测技术,患者可以在家中随时检测血糖浓度的变化控制饮食或及时就医。因此,无创血糖检测技术有着很大的研究价值和实用价值。血糖的无创检测可以说是近红外光谱在血液分析中应用最多的一个方面。葡萄糖在近红外光谱区(700m一1800m)有明显吸收,在2.Oμm-2.5μm范围内的吸收峰有:

2.105(4700𝑐𝑚−1),2.326μm(4300𝑐𝑚−1),和2.273(4400𝑐𝑚−1)(如图2)。

图2 葡萄糖在近红外区的吸收光谱

血糖近红外光谱定量分析的关键就是建立光谱数据和血糖度的关联关系。近红外光谱应用于血糖定量分析的方法是先选取一组具有代表性的、已知血糖浓度的样品作为校准集,测量出其近红外光谱,建立血糖浓度与近红外光谱之间的定量数学模型(校准模型);再取另一组已知血糖浓度的样品作为预测集.将预测样品的近红外光谱书记代入校准方程,得到样品的预测值,用预测值和化学测定值的相关系数和相对标准偏差来衡量所建模型的可靠程度;然后用稳定可靠的模型来对未知样品进行测定。样品采集的波段直接影响模型建立的效果,光谱数据的顸处理和所采用的化学计量学方法是提高信噪比获得好的分析结果的关键。近红外光谱的定量分析是以测定某特征官能团的吸收峰强度为基础的,此吸收峰叫“分析峰”。此分析峰应该选择在待测组分的特征吸收带处,强度尽可能大,与邻近谱带及杂质的谱带分离好,以防杂质和其他组分的干扰。吸光度的测量可采用顶点强度法和面积强度法。

当存在杂散光,或者类似现象如探测器的非线性,或在漫反射光谱中的表面反射作用于光谱时,会出现噪声。虽然这一效应对于当前大多数单色仪中发现的典型杂散光水平可忽略不计,但当FT

光谱仪中探测器的响应非线性,或当漫反

射测量中前表面反射大的时候,就不能忽略了。对于有效的杂散光水平10%而言,杂散光、表面反射和非线性探测器响应不影响最佳吸光度信噪比,但影响最佳浓度信噪比。

参考文献

1、裴卫平,季忠员,杨星近红外光谱技术在临床检测中的应用,北京生物医学工程,31(1),p.103-107, 2012

2、王景红、吉海彦近红外光谱技术在生物医学中的应用[会议论文] 2006

3、高博,魏蔚,龚敏,王丽利用近红外光谱检测多层组织血氧饱和度的研究光谱学与光谱分析 29(11),p2922—2925,2009

4、相韶霞、林凌、王艳秋、李刚近红外光谱组织血氧检测结果的定量化方法,光学技术27(5)p.451-454,2001

5、吴欣基于近红外光谱技术的脑血氧监测技术的研究[学位论文]硕士 2010

6、张洪艳近红外光谱技术在人体血糖无创检测中的应用研究[学位论文]博士 2005

7、刘庆珍徐可欣蒋诚志近红外光谱技术无创测量人体血糖激光生物学报 13(2) p129-135 2004

范文七:分子生物学与中医药

分子生物学技术在中医药研究中的应用及展望 崔林阁 第二中医临床学院07级中医临床2班 200706000204

【摘要】本文探讨了近年来分子生物学技术在中医药研究领域中的应用及其重要性,阐明把分子生物学的新技术引入到中医药研究中。不仅为解释中医药理论、加深对疾病本质的认识、探讨中药的作用机埋和研制新药提供了一种新的研究工具和方法,而且还将启迪新的思想和发展新的诊疗技术,必将对中医药学的变革和进步起到巨大的推动作用。

【关键词】中医药,疾病本质,中药机理,分子生物学

从人类基因组计划(HGP)的提出到完成,分子生物学以空前的力度正在改变人们的疾病观、健康观、生命观。伴随着这一研究热点的兴起和深入,各相关学科都以此为契机寻求进一步的拓展。作为正在探索现代化的中医学.也积极利用这一成果,以求进一步的发展。中医药理论与分子生物学虽然属于两种不同的体系,但两种科学研究生命活动的物质基础是一致的,因此,从分子水平研究中医药 ,对推动中医现代化,促进中医药学的发展以及防病治病很有意义。

一、分子生物学技术在中医研究中的应用

1.1 分子生物学技术在中医基础理论研究中的应用

阴阳学说是中医理论体系的高度抽象概括,“阴阳失调,百病丛生”,“谨察阴阳所在而调之,以平为期”是中医临床诊断和治疗的一项基本原则,从分子水平对其本质进行深入探讨是中医基础理论研究的一个新的方向。中医认为肾为先天之本,决定人的生长、发育、体质、生理、疾病、衰老等,但先天受后天的充盈和调节;现代分子生物学则认为,一个人的基因是机体生存和发育的主导因素,在一定意义上,决定和影响人的生老病死等,但基因并不是所有,他受生活环境、习惯、锻炼等诸多因素的影响等,两者在论述和概念上有惊人的相似之处。李芳生[1]从生物信息系统的活性物质如cAMP和cGMP,TXA2和PGl2在对生物功能调节中恰如相反的分子生物学效应,论述了中医阴阳理论与生物医学研究的重要意义。与此理论相一致,分子生物学研究发现[2],癌症的发生与正常细胞中的原癌基因和抑癌基因有关,如前者激活成为基因异常表达,或后者缺失不能发挥正

常细胞生长调节和终止分化作用,就可导致肿瘤发生,这说明原癌基因与抑癌基因两者平衡失调对肿瘤发生起着重要作用。

中医脏象学说认为肾为先天之本,主生长发育,生殖,肾生髓。杨金蓉[3]运用“恐伤肾”原理恐吓母鼠,造成子鼠先天肾气亏虚的动物模型,然后检验子鼠胸腺核酸含量,发现恐吓各组DNA、RNA含量及RNA/DNA值均有所降低,且恐吓程度越重降低越明显;王米渠[4]观察受惊吓母鼠所生子鼠大脑皮层厚度变薄,尤以分子层明显变薄,说明围产期紧张情绪直接影响到下一代子鼠的生长发育;王宇[5]等提示“恐伤肾”使子代小鼠IL-2活性处于亢进状态,而经典补肾方药“金匮肾气丸”对其有一定调节作用。

活血化瘀理论是中医病因病机学说的一个重要内容,近年来的研究发现痰浊瘀血状态与病理性代谢产物积聚有关,继而分泌某些细胞或体液因子刺激基因异常表达,引起细胞异常增殖;活血化瘀药能在细胞和基因水平发挥干预作用[6]。

1.2 分子生物学技术在中医“证”实质研究中的应用

中医药理论的核心是辨证论治,而辨证论治首先要从研究证着手。所以做为概括病变某一阶段的内在病理本质和外部客观表现的证,是辨证学研究的主要对象,亦是中医迈向现代化的起点之一。自20世纪80年代以来,这方面的研究较为突出,如对肾虚证、脾虚证、血瘀证以及阴虚和阳虚证,运用了现代科学的各种技术、方法,从多学科、多途径和多层次在整体水平、器官水平、细胞水平、分子水平进行了研究,从总的研究成果来看,整体水平、器官水平、细胞水平的研究较为广泛而深入。而分子水平的研究显得少的多,主要如沈自尹用RtPCR技术发现肾阳虚证和下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素的mRNA表达受抑,将肾阳虚证定位在下丘脑[7、8]。并进一步研究表明温补肾阳药是直接提高下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRF)基因的转录和表达水平,从而改善下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺(HPAT)轴的受抑状态,说明肾阳虚证的调控中心定位于下丘脑,而且涵盖神经内分泌免疫网络[9,10]。刘福春[11]通过3HTdR掺入细胞核DNA的方法,发现“阳虚”动物骨髓细胞DNA合成率下降。所以要想更深入的研究证的本质和内涵,这方面的研究还必须更多的进行,在大量研究的基础上,我们不仅可以更深入的探讨证的本质和内涵,而且还可能建立证型基因表达谱数据库,更好地为临床服务。

1.3 分子生物学技术在中医衰老机理研究中的应用

衰老这一生命现象的变化,是相互联系的多虚实因素综合作用的结果。 沈少珩等[12]研究发现老年大鼠肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性降低与其酶蛋白的mRNA表达水平减弱相关,经中药二仙汤及其拆方治疗后,SOD和CAT活性升高,其mRNA基因表达水平也随之增强有关。廖柏松等[13]观察了二仙汤对老年前期雌性大鼠下丘脑内阿片肽(EOP)含量及其mRNA水平的调节作用,发现二仙汤明显提高老年前期大鼠下丘脑EOP的基因转录水平(mRNA水平)和基因表达水平(EOP含量),向青年鼠水平靠拢。吴志奎等[14]认为DNA甲基化水平的提高可维持基因的正常表达,阻止异常基因(癌基因、衰老基因)的表达,用HPLC法分析了生理性肾虚老龄大鼠肝细胞DNA的甲基化水平,发现神方补肾生血药可明显增高其DNA的甲基化水平。姚明忠等[15]研究了固真方对老年大鼠肝细胞增殖有关基因——原癌基因(c-fos,c-jun)和β-微管蛋白基因表达的影响,表明固真方具有进细胞增殖与分化、延缓衰老的作用。徐桂香等[16]研究抗衰延寿方对老年鼠肝DNA碱变性增色效应的影响发现,抗衰延寿方能减少鼠肝DNA的损伤,维持DNA正常的有序结构;还可改善小鼠肝DNA溶解度和热增色效应老化性改变

[17],增加老年大鼠肝细胞核双链DNA解旋剩余率[18],DNA单链断裂点及非组蛋白含量呈现好转趋势[19]。温富春等[20]研究发现中药制剂夕阳红口服液能促进小鼠肝脏中RNA、蛋白质的合成,能使肝与脑中MDA的含量降低,同时能明显抑制小鼠肝脏中MAO-B的活性。张志钧等[21]发现金水宝胶囊能消除老年虚证氧自由基,DNA损伤后修复。

二、分子生物学技术在中药研究中的应用

2.1 分子生物学技术在中药抗病机制研究中的应用

目前主要通过中药对疾病相关基因的干预和调控作用来探讨中药的作用分子机理与作用靶点。吴志奎等[22]发现补肾生血药(山茱萸、熟地黄、龟板胶、阿胶等)能明显提高β-地中海贫血患者的血红蛋白(Hb)和抗碱血红蛋白(HbF),其作用机理可能是补肾生血药能提高血红蛋白的珠蛋白链γ/γ+β比值,促进γ-珠蛋白的基因转录和表达,诱导HbF合成从而代偿了β-珠蛋白基因功能的缺陷。

谢金锦[23]等进行了“补阳还五汤对球囊扩张主动脉后再狭窄其内皮血小板衍化生长因子受体和SOD-1基因表达的探讨”的研究,结果表明补阳还五汤增

强动脉内皮SOD-1的基因表达,改善缺血再灌注的供氧,同时抑制血小板衍化生长因子受体的mRNA表达,以控制细胞的病理性增殖,提示补阳还五汤的主要治疗机理之一是调整机体平衡,并非专一的单因子作用。

张国强[24]研究了丹参对狼疮性肾炎的影响,结果表明丹参对人肾脏纤维细胞增殖有抑制作用,并通过使C-myc蛋白高水平表达而诱导细胞凋亡。故在临床上丹参是治疗狼疮性肾炎及肝硬化、手术疤痕形成等纤维化病变的有效药物。

王振义[25]研究发现砷剂可促进急性促幼粒细胞白血病 (APC)细胞株NB4细胞凋 亡,进一步研究发现AS2O3对bcl-2基因的表达,无论从mRNA还是从蛋白水平,都具下调作用,而bax、bcl-x、C-myc和P53基因的表达不受影响,因而认为砷剂主要是通过促进APC凋亡而治疗早幼粒细胞白血病的。特别是陈竺院士对砷制剂和三氧化二砷的研究,使砷制剂得以在临床广泛的应用,对中医以毒攻毒理论及毒性中药的在认识打下了基础 ,也为中药走向国际市场提供了可借鉴之处 。

2.2 分子生物学技术在新药研发中的应用

中药治病的原则是“调整阴阳,以平为期”,以方剂为载体,注重整体,采用辩证论治的方法,进行综合治疗的思想,符合现代治疗学的发展治疗趋势,然而传统中医药缺乏对药效物质微观作用机理的科学阐述,成为影响中医药迅速发展的瓶颈,由于生物芯片具有高通量、并行性以及样品消耗量较少的优势,在中药研究特别是新药设计与开发中更是独具魅力。通过在集成了成千上万的基因、抗原等生物信息在芯片上微缩化和快速化的生化反应,不仅可达到鉴定中药品质、分析中药中各个组分的含量、阐明中药作用机制等目的,而且可以通过比较与一些疾病相关的可能的基因位点在使用中药前后的变化,确定有较明显变化的部位,筛选出该中药的作用位点,阐明中药作用靶点,再结合生物信息学,就可 以建立一套新的药物设计方法,进行新药的设计和开发。

如果充分利用人类基因组学和蛋白质组学的研究成果,通过分子生物技术将选定的中药或中药复方进行多靶筛选,建立其基因表达谱,从中找出与疾病相关基因的关联,进一步优化筛选靶标,通过处方分析,在分子水平阐明优化中药处方或工艺等方面的作用机理,就可以开发出具有国际水平的创新药。

2.3 分子生物学技术在中药鉴定及改良保护等方面的应用

分子生物学的出现,是对中医药鉴定技术的一种补充和完善。目前常用的核酸分析方法主要有限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)、随机扩增多态性DNA(PAPD)、高特异性PCR扩增(PCR—RFLP)的特定片段的限制性位点分析、DNA序列分析、扩增片段长度多态性法(AFLP)、基因芯片技术,这几种技术鉴定中药,可以不受药物的形状、剂型等外界因素和生物发育阶段及器官组织差异的影响,直接、便捷、准确地鉴定中药材[26]。

另外分子生物学在保护濒危紧缺的中药资源方面也做出了很大的贡献。目前许多中草药都面临着野生资源逐年减少和栽培品质下降的问题,给临床使用和 中成药制造带来一定的困难,应用药用植物转基因器官培养技术生产的次生代谢物质正涉及到生物碱、甙类、黄酮类、醌类及蛋白质等。此外利用转基因技术获得再生植株,可进行药用植物良种繁殖,提高药材质量并获得一些具有合成化合物能力的突变植株。胡之璧等应用植物细胞培养技术进行洋地黄培细胞的生物转化研究,筛选出高产细胞并获得了相当好的遗传稳定性[27]。另外已培养出抗癌活性成分三尖杉酯含量高于原植物的三尖杉培养细胞[28]。同时利用基因工程技术研制的转基因动物、植物可以定向生产主要的生物活性成分,并能以此创造和改造天然活性成分,使转基因动物、 植物成为生产中药活性成分的 “活体工厂”。在国外,人参和紫草以转基因等生物技术已达生产规模。有效成分为蛋白肽类(生物体内由基因指导合成)的中药,可通过提取或克隆出其特定的基因,利用转基因技术,将之转至易表达、易培养的生物体内,进行大规模传代培养。瓜萎中的天花粉蛋白强烈抑制HIV病毒和很多其他病毒,具有显著的临床效果,其需求量日益增大。现在其编码基因已克隆 出来,并且在大肠杆菌中高效表达。生物技术的发展使利用转基因动物获得像麝香、牛黄、犀牛角等一些动物性中药成为可能,从而大大节省资源,保护了这些濒危的动物。

三、发展与展望

应用分子生物学技术开展中医药的研究,从基因和分子水平研究疾病本质和中药作用原理,虽然已取得了许多可喜的成就,为中医药现代化研究开辟了一个新的领域,但仍然处于起步阶段。今后应加强中医“证”的基因动物造模和中医辨证分型的分子基础研究,以期全面阐释中医理论,加速中医学发展;还应深入探讨中药如何特异性调节基因活动,以及如何调动机体自身的DNA修复机能,

并从中筛选出疗效确切、针对性强、有应用前景的中药。相信分子生物学理论和技术在中医药研究领域中的广泛应用必将极大地推动中医理论和临床实践向前发展。

参考文献:

[1]李芳生.中医阴阳学说的分子基础[J].辽宁中医杂志,1998,25(4):156-157

[2]李贺.中医基础理论与现代医学进步[J].辽宁中医杂志,1998,24(7):294-295

[3]杨金蓉.孕鼠“恐伤肾”对子代胸腺核算含量的影响[J].成都中医药大学学报,1998,21(2):3-40.

[4]王米渠.试论“肾通于脑”的信息神经观[J].成都中医药大学学报,1997,13(622):1-2.

[5]王宇.惊恐孕鼠对子代小鼠IL-2活性的影响[J].成都中医大学学报,1998,21(1):29-30.

[6]李静.中药对血管平滑肌细胞增殖及其基因表达的影响[J].北京医科大学学报,1994,26(增刊):243

[7]沈自尹.肾阳虚证定位的研究[J].中国中西医结合杂志,1997,17(1):10

[8]钟历勇,沈自尹,蔡定芳,等.补肾健脾活血三类复方对下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴及CRF基因表达的影响[J].中国中西医结合杂志,1997,17(1):9

[9]沈自尹.21世纪-中西医结合走向后基因组时代[J].中国中西医结合杂志,1999,19(20):808

[10]沈自尹.再从证的研究探讨中西医的互补性[J].中国中西医结合杂志,1999,19(3):180

[11]刘福春,丁光霞,李菊仙.淫羊藿多糖对羟基脲所致“阳虚”动物骨髓细胞DNA合成率的影响[J].中国中药杂志,1991,16(10):620

[12]沈少珩. 二仙汤及其拆方对老年大鼠部分抗氧化酶活性及其基因表达水平的影响[J].中国中西医结合杂志,1995,15(1):672

[13]廖柏松,方肇勤. 二仙汤对18月龄雌性大鼠下丘脑EOP含量及其mRNA水平作用的实验研究[J].山东中医学院学报,1996,20(6):399-401

[14]吴志奎. 肾生髓理论分子基础的研究[J].中医杂志,1996,37(2):109-110

[15]姚明忠,丁卫. 固真方对老年大鼠肝脏增殖有关基因表达的影响[J].中国中医药科技,1996,3(3):17-18

[16]徐桂香,张克纯. 抗衰延寿方对老年鼠肝DNA碱变性增色效应的影响[J].湖南中医学院学报,1992,12(4):39-41

[17]张克纯,郭语彬. 抗衰延寿方对老年小鼠肝DNA热稳定性的影响[J].湖南中医学院学报,1992,12(4):42-44

[18]徐桂香,张克纯. 抗衰延寿方对老年大鼠肝细胞核DNA单链断裂的影响[J].湖南中医学院学报,1992,12(4):45-47

[19]张克纯,徐桂香. 抗衰延寿方对老龄动物染色质改变影响的研究[J].中国中医药科技,1995,2(3):34-36

[20]温富春. 夕阳红口服液药理作用的研究[J].长白山中医药研究与开发,1995,4

(3):42-45

[21]张志钧. 金水宝胶囊消除老年虚证患者氧自由基及DNA损伤后修复作用的临床和实验研究[J].中国中西医结合杂志,1997,17(1):35-38

[22]吴志奎,蔡辉国,陈佩真,等.补肾生血方对B-地中海贫血基因水平的影响

[J].中医杂志,1997,38(2):91

[23]谢金锦,侯灿,吴伟康,等.补阳还五汤对球囊扩张主动脉后再狭窄内皮PDGFR和SOD-1基因表达的探讨[J].中国中西医结合杂志,1997,17(10):611

[24]张国强,叶任高,孔庆瑜.丹参对狼疮性肾炎成纤维细胞增殖,凋亡及C—myc蛋白表达的影响[J].中国中西医杂志,1997,17(8):473

[25]王振义.开展砷剂治疗白血病的临床和机制研究[J].中华血液学杂志,1996,17(2):57

[26]詹秀琴,王明艳.分子生物学技术在中药鉴定中的应用及探讨[J].生物学通报,2001,36(1):3

[27]胡之璧.传统药材和现代生物学技术[J].上海中医药大学,上海市中医药学研究院学报,1996~1997,96

[28]胡之璧.三尖杉培养细胞抗癌活性成分的研究[J].植物学报,1995,37(6):417

范文八:分子生物学与中医药

分子生物学技术在中医药研究中的应用及展望

卢晓丹 07级中医临床2班 200706000240

【摘要】将分子生物学技术引入到中医中药的研究上来,从基因和分子水平研究中医藏象学说、针灸学、中医临床以及中药鉴定培育与开发等方面应用的作用,既不脱离中医的整体观,又能使中医从客观化、定量化上与综合、演绎的方法联系在一起,填补中医缺乏微观还原分析的空白,不但有利于中医从朴素的方法论尽快地转到现代辨证的方法上来,也有利于利用基因组学这一纽带将传统的中医与现代医学紧密结合。

【关键词】分子生物学;中医现代化;应用及展望

中医理论主要阐述了人体生理、病理、病因及疾病的预防、治疗原则等内容,虽然受到了当时社会历史条件及科学发展水平的限制而导致其中存在一些糟粕,但瑕不掩瑜,中医药学仍以其辨证的整体观、构成论的研究方法、辨证论治的治疗模式以及属于天然植物药的中药所特有的低毒性、无耐药性、具有整体调节效应等优势而逐渐为世界上其他国家所认同并引起了持续升温的中医热。但是中医药学要想真正走向世界,仅凭祖先传下的传统中医理论是不够的,我们必须使之与现代医学相结合,从现代医学的角度阐明中医辨证原理及中药的作用机理。这样,传统的中国中医药学才能转变为现代中医药学,并真正成为世界的中医药学。 分子生物学是一门从分子水平探讨生命现象及其规律的学科。20世纪50年代以来,分子生物学在生命科学领域中发挥了极其重要的作用,推动着生命科学中其他学科的发展。而以分子生物学方法来研究中医药,来阐明两者之间的内在联系,使两者有机地结合起来,各取所长,这样才能加快中医药学走向世界的步伐。中医药“拿来”分子生物学不仅是必要的,而且是可行的。由于中医药学对现代科技具有广阔的包含性,留给分子生物学的空问很大,作为生命科学带头学科的分子生物学的引入必将极大的推动中医药学的发展。

一.分子生物学技术在中医研究中的应用

1.1 分子生物学技术在中医藏象理论研究中的应用

分子生物学技术在中医藏象理论中的应用主要体现在肾与基因关系的探讨。

中医认为肾具有藏精、主生长发育和生殖的功能,肾精是肾主生长发育的物质基础,它包括“先天之精”和“后天之精”。两者共同作用从而发挥促进机体生长、发育和逐步具备生殖能力的“先天之精”的功能。现代分子生物学研究证实,基因与人体的生长发育有密切关系,基因是生物体内特定的DNA核苷酸片段,是生物遗传的基本单位,基因的表达与调控直接影响着细胞的增殖与凋亡,决定着人体的生长发育、衰老、生殖、遗传,与中医“肾主生长发育”之间有着许多内在关系[1]。“肾主生长发育”另一方面的体现是在人体衰老过程中的作用,近年来,国际上对衰老分子机理的研究颇为关注,并逐渐深入。张晓文等[1]鉴于基因对衰老的调控作用同中医关于肾气盛衰对衰老的决定作用有一定的相似性,推论出“肾主生长发育”的实质就是基因调控,从而深化了对中医“肾气”的认识,为从基因表达与调控角度阐述补肾中药延缓衰老的机制提供了理论依据和启示。亦有研究表明,部分中药抗衰老机制是通过改善老年人的DNA修复能力而实现的。另外中药抗衰老还可通过基因调控,以增强编码抗氧化酶的mRNA表达水平。另有研究发现中药除通过改善老年人的DNA修复能力而实现抗衰老外,还可清除自由基、增强神经生长因子(NCF)受体等作用来达到抗衰老之目的[2、3]。在肾主骨生髓理论研究方面,刘福春等通过细胞培养技术和测定3HTdR掺入细胞核DNA的方法,发现“阳虚”动物骨髓细胞DNA合成率下降,因而认识到中医肾主骨生髓理论与促进核酸蛋白质代谢有关。杨金蓉[5]运用“恐伤肾”原理恐吓母鼠,造成子鼠先天肾气亏虚的动物模型,然后检验子鼠胸腺核酸含量,发现恐吓各组DNA、RNA含量及RNA/DNA值均有所降低,且恐吓程度越重降低越明显。以上都说明中医脏象学说是有分子生物学基础的。

1.2 分子生物学技术在针灸研究中的应用

研究证明,中医药、针灸学在功能基因调控方面具有巨大的潜在优势,已有不少报道中医药及针灸能对某些关键性基因起到调控作用,从而改善甚至纠正其病理状态,达到国际前沿水平[6]。随着针灸学应用和研究世界化的趋势,其治疗机制的阐释显得日益重要[7]。发挥针灸的疗效优势,结合针灸在调控功能基因方面的潜在优势,对其治疗机制加以阐释,已成为针灸学研究的一项非常重要的内容。针灸学研究结论涉及到不少生命科学还不能解释的问题,如经络现象、腧穴现象和针灸治疗机制等。针灸科学已经成为生命科学的一个重要组成部分,针灸[4]

学的任务是应用针灸的方法探索生命科学并在临床上应用其成果[8]。分子生物学的理论和方法在针灸学研究中的应用日趋广泛和深入,促使一些基于分子生物学的全新针灸理论应运而生,如“针灸基因组学”的提出,便是其中之一。可以说,基因研究的大背景,推动和加速了针灸学的发展,并有望解开针灸科学中的诸多之谜。

分子生物学的理论和方法在针灸学研究中的应用主要表现在对针刺介导下一些基因表达调控的观察。其内容主要包括:针刺对即刻早期基因家族的影响,对神经肽、神经递质、激素及其相关受体的影响和基因技术在针灸基础理论研究中的应用(针刺起效时间、电针频率)等。近年来有关针刺对基因表达的影响几乎集中在动物实验方面,主要涉及疼痛、癫狂、老年性痴呆、系统再生与修复、免疫系统及内分泌系统等一些疑难及重大疾病,并且研究方向已触及到细胞增殖与凋亡、信号传导、神经再生及发育等热门领域,所用方法有免疫组化、PCR、原位杂交、斑点杂交等分子生物学技术。

1.3 分子生物学技术在中医临床研究中的应用

分子生物学的研究结果表明,人类遗传病、肿瘤、心脑血管病等多种疾病与基因的突变、缺失、插入、表达异常、调控异常有密切关系。运用中医药治疗这些疾病疗效显著,而且毒副作用小,如根据中医“肾主生殖”理论,运用肾气丸治疗男性不育等男科疾病,其机理为肾气丸能促进体内雄性激素睾酮与核内受体结合,进而启动DNA转录并促进RNA合成[10]。王乙忠等[11]运用纯中药制剂扶正抑癌冲剂治疗微小残留白血病(MRL),DNA指数及非整倍数率均呈现下降或恢复正常,PH染色体明显减少,运用PCR检测BCR/ABL基因转阴,表明该方具有抑制或消除恶性克隆的作用。

吴志奎等[12]运用补肾生血药治疗β-地中海贫血,能明显提高β-地中海贫血患者血红蛋白和抗碱血红蛋白,提高血红蛋白珠蛋白链比,通过Pt-PCR检测,该药能促进γ-珠蛋白的mRNA基因转录和表达,诱导HbF合成,从而代偿了γ-珠蛋白基因缺陷。

王树庆等[13]运用补肾化瘀汤治疗慢性再生障碍性贫血患者,影响骨髓AgNORs细胞的机理可能与改善骨髓循环或刺激造血细胞,从而促进rDNA和rRNA的合成代谢有关。 [9]

二.分子生物学技术在中药研究中的应用

中药学是中医学的重要组成部分,也是分子生物技术充分被利用的一个颁域。现代药理研究已明确药物都有其“靶基因”。反之对疾病有效的方药,必有靶基因。靶基因是中药作用的最本质的指标。在中药研究中探求哪些中药可提高哪些基因的表达,抑制哪些基因的表达。这种研究可使中药学研究摆脱低水平重复的局面。

现代分子生物学技术在中药材鉴别,优良中药品种的培育,中药资源开发,中药有效成分的提取,中药作用机理研究等方面显示出广阔的前景。

2.1中药DNA分子标记鉴定。应用细胞遗传学技术,通过观察不同药材中不同染色体的数目、形态、组型和带型,可对药材进行鉴定。

2.2药用植物分子标记育种。药用植物基因和转基因工程可培养药用植物优良品种,提高药材有效成分,还可保护珍稀动植物药材。因此在传统生产和加工中具有重要作用[15]。

2.3中药成分快速高通量筛选。DNA芯片技术可用于高通量筛选中药有效成分[16]。利用转基因动物建立敏感动物品系及人类疾病的动物模型,用于药物的筛选.其结果准确、可靠、经济。已在中药中筛选抗肿窟药物、抗肝炎药物等方面取得突破性进展[17]。

2.4动植物反应器中生产中药有效成分。利用转基因器官培养技术,可大量获取原本含量很微小的有效次生物质;通过在人工培养过程中有目的的加入巳知的有效代谢中间产物、促进荆或抑制剂,可明显增加有效成分的产量[18]。

2.5中药作用机理研究。在基因及分子水平上对中药作用机理进行研究,中药可能对调控修饰疾病相关基因表达及表达产物发挥作用。此类研究以抗肿瘤类、活血化瘀类、延缓衰老类及免疫调节类较多[20]。在DNA芯片和中药指谱技术支持下,可研究中药方剂中的各种中药成分的组分的多途径、多靶点的整体调节作用。

三.分子生物学技术在中医药研究中的应用展望

现代的生命科学不仅是指时间上而主要指研究层次和研究水平已进入了新纪元,主要标志就是基因组学的建立和分子生物学技术的应用,使人类认识了生命的本质,它们既代表生命科学的前器,又是生命科学各学科的基础。 [21][19][14]

由于中医药学具有博大的包容性,故运用分子生物学来研究中医药是切实可行的。从科学技术发展规律的本身来看,不仅要注重在本学科范围内进行研究,还必须与现代自然科学紧密结合,善于吸收,借助现代自然科学的知识和技术来不断地提高自己,才能有较快的发展。因此中医药学引进分子生物学的知识和技术不但是可能的,而且是必须的,这是当代自然科学相互渗透发展规律的要求。

自从20世纪50年代分子生物学建立以来,该学科就一直以惊人的速度迅速发展,成为当今生命科学中最重要同时也是最具活力的一门学科,它已经渗透到了社会各个领域,分子生物学的发展,为中医药学及其理论与实践的研究提供了难得的机遇。目前,运用分子生物学知识与技术研究中医药学,在国际、国内均尚处于起步阶段,还有许多新的领域尚未探索。相信分子生物学理论和技术在中医药学研究领域中的广泛应用必将极大地推动中医理论和临床实践向前发展,最终使中医药走向现代化。

参考文献:

[1]张晓文,宋清.从基因角度探讨“肾主生长发育”的本质[J].中医药研究.1996,(3):12

[2]刘亚梅,陈群.分子生物学与现代中医药学的研究进展[J].安徽中医学院学报.2000,19(1):57

[3]周坤福.分子生物学与中药开发[M].北京:人民卫生出版社.2000.184

[4]刘福春,丁光霞,李菊仙.淫洋藿多糖对羟基脲所致“阳虚”动物骨髓细胞DNA合成率的影响[J].中国中药杂志,1991.16(10):20

[5]杨金蓉.孕鼠“恐伤肾”对子代胸腺核算含量的影响[J].成都中医药大学学报,1998,21(2)3-40

[6]沈自尹.21世纪-中西医结合走向后基因组时代[J].中国中西医结合杂志,2000.20(11):808-810

[7]王本显,马文礼.中医药及针灸在美国的历史、现状与展望[J].中国针灸,1999,19(8):503-506

[8]陈汉平.针灸研究的现状及展望.21世纪中医药发展国际研讨会论文集[C].南京:江苏科学技术出版社,2001.4-6

[9]顾健人.我国基因诊断与治疗的前景及有关问题 [J].中华医学杂志,1995,75(9):517

[10]张柏丽.肾气丸对大鼠睾丸组织内DNA和RNA含量的影响[J].天津中医,1995,12(4):30

[11]王乙忠.扶正抑癌冲剂配合化疗治疗微小残留白血病的临床与实验研究[J].中医杂志,1996,37(9):535-538

[12]吴志奎.肾生髓理论分子基础的研究[J].中医杂志,1996,37(2):109-110

[13]王树庆.补肾化瘀汤对慢性再生障碍性贫血患者骨髓细胞嗜银蛋白的影响

[J].中国医药学报,1997,12(1):16-18

[14]王健云,付文,范亚刚.细胞与分子遗传性技术鉴定药材简介[J].中国药事,1998.12(6):377

[15]刘涤,胡之蔓,孙纯清.传统药材生物技术研究中药现代化的重要内容[J].国外医学·植物药分册,1998,13(6):245

[16]阮秋蘑,束建新,邓仲璜.川芎嗪抗血栓形成的机制研究[J].中国动脉硬化杂志,1998,6(4):297

[17]周勇,张斌,陈匿平.受体克隆技术与转基因动物在药物筛选中的应用[J].中国药学杂志,1998,34(10):654

[18l周海钧.21世纪新药研究与开发的展望[J].中国新药杂志,2000.9(1):4

[19]雷燕,黄启福,王永炎.浅谈分子生物技术在中医药研究领域中的应用[J].北京中医药大学学报,1998,21(6):27

[20]陈苏红,王晓红,王升启.中药影响细胞基因表达的研究进展[J].中国中医药杂志,2000,25(9):515

[21]艾铁民.基因组学为中医药现代化奠基[J].中国中医药信息杂志,2002,9(3)

范文九:医学分子生物学教学大纲

《医学分子生物学》 (供中药,制药,药检专业用)

湖南中医药高等专科学校药学系

《医学分子生物学》教学大纲

(供中药,制药,药检专业用)

一、大纲说明

(一)课程的学科性质、研究对象和任务

医学分子生物学是研究生命化学的科学,它在分子水平探讨生命的本质,即研究生物体的分子结构与功能、物质代谢与调节及其在生命活动中的作用。医学分子生物学是学生必修的基础医学课程,为学习其它课程、在分子水平上认识病因和发病机理、诊断和防止疾病奠定扎实的基础。当今生物化学越来越多的成为生命科学的共同语言,它已成为生命科学领域的前沿学科。

(二)课程的地位、作用

医学分子生物学是在分子水平上阐明生命现象的科学,它的理论和技术已经渗透到其他基础医学和临床医学和整个医药卫生的各个领域,被用以解决医学各门学科中存在的问题。分子病理学、分子药理学、免疫化学、临床酶学以及生物工程学等相继崛起,使生化药物和生物工程产品应用于临床实践,前景诱人。 医学生物化学是医学科学重要的一门基础课,作为医学生,应很好学习并系统地掌握其基础理论知识和必要的技术手段。掌握了医学分子生物学知识,对于学习基础理论和在实践中应用会有很多帮助。

现代的生化理论和技术有着广泛的实用价值。应用生化技术检查体内代谢改变的某些指标,对疾病的诊断可提供重要的参考;根据生化理论解释病因,对于某些疾病设立施治方案具有针对性。总之,医学生物化学的理论知识与技术,是现代基础和临床医学理论及实践体系中的一个重要组成部分。

(三)课程的教学目的和要求

这门课主要向学生传授遗传信息的贮存、传递与表达(DNA的生物合成、RNA的生物合成、蛋白质的生物合成、基因表达调控、基因重组与基因工程);细胞间信息传递;血液、肝的生物化学;钙、磷代谢与微量元素等生命科学内容,使医学学生为深入学习其他医学基础课、临床医学课程乃至毕业后的继续教育、医学各学科的研究工作中在分子水平上探讨疾病的病因、发病机理及疾病诊断、预防、治疗奠定理论与实验基础。

为了学习和掌握分子生物学的原理和方法,要求学生必须具有较好的生物学

物理学和化学方面的基础,能够将这些基础知识运用到医学分子生物学的学习中,要求学生能从生物大分子的组成﹑结构和性质去认识结构与功能的关系;物质代谢和能量代谢的关系以及代谢调节的意义;基因信息传递的分子基础;重组DNA和基因工程技术及其与医学应用的联系;细胞信息传递以及与临床密切相关的血液生化、肝胆生化,基因诊断,基因治疗等。

(四)课程选用的教材、教学的基本内容和重点

本大纲的配套教材为药立波主编的《医学分子生物学》(人民卫生出版社出版,第三版)。

从医学分子生物学不断发展与其应用范围日益扩大的实际考虑,为密切结合教学需要,本课程参考现行学时数主要介绍以下几方面内容:

(1)阐明遗传学中心法则所揭示的信息流向,包括DNA复制、RNA转录、翻译、DNA的损伤与修复、基因表达调控;

(2)概要地介绍与疾病相关的分子生物学基础;

(3)概要地介绍重组DNA和基因工程技术及其与医学应用的联系、基因操作,基因诊断;

(4)概要地介绍细胞信息传递及其途径;

(五)课程的教学方法、教学手段和特点

⒈讲课 根据具体教学内容,采用大班讲授与小班讨论相结合的方法。教师在充分备课、写好教案、集体备课的基础上,利用制作好的多媒体教学课件,加强直观教学,以加深学生对有关内容的理解和记忆。讲课要采用启发诱导,实例分析,习题作业,课堂讨论等多种形式,生动活泼,突出重点和难点,以调动学生的思维活动,培养分析问题和解决问题的能力。对学有余力的学生,积极开展第二课堂,因材施教。

⒉实验 通过多媒体手段下载有关生化实验的最新方法和技术播放给学生观看,尽可能让学生了解本学科的前沿知识。

⒊自学和第二课堂活动 学生在听课和实验的基础上,积极主动地自学。对学有余力的学生,通过指定课外阅读资料,翻译专业文献,专题讲座,组织业余兴趣小组等形式适当提高。对学习有困难的学生,应帮助其分析原因,指导学习方法。 ⒋复习过程中,及时了解学生学习情况,针对存在的问题进行答疑。

(六)学习本课程的基本方法和途径

本课程的一个特点是各章节之间联系紧密,与其它学科也有很大联系。因此,在学习过程中必须加强相关章节、相关学科知识的学习,特别是必须在学好有机化学、生物学等学科的基础上,才能较好地理解生物化学的有关内容;另一个特点是内容较抽象,自学难度较大,必须进行课前预习,充分利用老师的课堂讲授理解所学的内容,课后及时复习,一定的习题练习也有助于理论知识的理解。 由于学生需要学习的课程多,学习任务繁重,不可能对每门课程的所有内容都能全面掌握,因此,必须根据教学大纲,抓住重点,有目的地对要求掌握的内容在理解的基础上进行记忆。可采用循环学习法,即每隔一定时间复习一次,但复习一次相同内容所用的时间越来越短,印象却越来越深,从而达到巩固知识的目的。

二、教学内容

本大纲共二十五章,内容要求划分为掌握、熟悉和了解三个层次。

绪 论

教学目的与要求

【掌握】

医学分子生物学的概念。

【熟悉】

医学分子生物学的研究内容。

【了解】

医学分子生物学与其它学科之间的关系,它的发展史以及现状和未来。 教学内容

1.医学分子生物学的定义

2.医学分子生物学发展中的重要事件

3.医学分子生物学的现状和未来

教学方法

课堂讲述结合多媒体图片教学,重点内容详细讲解,特别是绪论部分要多举实例让学生更好的理解

第一章 基因的结构与功能

教学目的与要求

【掌握】

1.核酸的化学组成

2.DNA三级结构

3.RNA的结构与功能

【熟悉】

基因的功能与组构

【了解】

1.小分子RNA的种类和功能,

2.核酸酶

教学内容

第一章 基因的结构与功能

第一节 基因的化学结构

一、DNA和RNA的化学组成

二、DNA的一级结构

三、DNA的二级结构

四、DNA在细胞内组装为致密结构

第二节 基因的功能与组构

一、结构基因为多肽链和特定RNA分子编码

二、基因包含结构基因和调控基因

第三节 RNA的结构与功能

一、信使RNA具有特征结构

二、转运RNA有氨基酸接纳茎和反密码环

三、核糖体RNA是核糖体的组成部分

二、小分子RNA有不同的种类和功能

第四节 核酸酶

教学方法

本章的难点是基因的结构及基因结构与功能的关系,讲授过程中充分利用多媒体课件,用动画等三维空间结构图形象、生动地讲授结构基因和调控基因的相互作

用及其空间结构。

第二章 基因组的结构与功能

【掌握】

人基因组存在大量重复序列的特点

【熟悉】

原核生物基因组的结构与功能

【了解】

1.多基因家族与假基因

2.病毒基因组的结构与功能

教学内容

第一节 人基因组的结构与功能

一、人基因组中只有不到三万种基因

二、人基因组中存在大量重复序列

三、多基因家族与假基因

四、线粒体DNA结构有别于染色体DNA

第二节 原核生物基因组的结构与功能

一、原核生物基因以操纵子方式组构

二、原核生物中的质粒DNA

第三节 病毒基因组的结构与功能

教学方法

首先从基因组在生命活动中发挥着不可替代的作用,激发学生的学习兴趣。讲授过程中分析与综合相结合、常规讲授与多媒体教学相结合、启发式教学与课堂讨论教学相结合等教授方法。

第三章 基因组复制

教学目的与要求

【掌握】

1.DNA复制过程的共同特点

2.原核生物DNA复制的基本过程

3.真核生物DNA复制的基本过程。

4.真核生物DNA复制与原核生物的主要不同点

【熟悉】

1.基因组DNA复制的基本过程

2.原核生物DNA复制的调控

3.真核生物DNA复制的调控

【了解】

某些病毒基因组的复制

教学内容

第一节 基因组DNA复制的基本过程和共同特点

一、DNA复制是酶促化学反应

二、DNA复制的基本过程

三、DNA复制过程的共同特点

四、DNA复制的保真性

第二节 原核生物DNA的复制

一、大肠杆菌DNA聚合酶

二、大肠杆菌基因组DNA复制的基本过程

三、原核生物DNA复制的调节

第三节 真核生物DNA的复制

一、真核生物DNA复制与原核生物的主要不同点

二、真核生物染色体DNA复制的基本过程

三、真核生物DNA复制的调节

四、线粒体DNA的复制

第四节 某些病毒基因组的复制

一、腺病毒DNA的复制

二、单链DNA病毒基因组的复制

三、反转录病毒基因组的复制

四、乙型肝炎病毒基因组的复制

教学方法

以DNA复制所需的条件为主线,讲授过程中联系前面已讲授的DNA双螺旋结构知

识,做到知识的连贯,充分利用多媒体课件,用动画等三维空间结构图形象、生动地讲授DNA生物合成过程。

第四章 DNA的损伤与修复

教学目的与要求

【掌握】

DNA损伤的修复

【熟悉】

1.DNA损伤的多种因素

2.DNA损伤的机制

【了解】

DNA损伤和修复的意义

教学内容

第一节 DNA损伤

一、导致DNA损伤的多种因素及其机制

二、DNA损伤以多种类型存在

第二节 DNA损伤的修复

一、某些DNA损伤可以直接修复

二、切除修复是最普遍的DNA损伤修复方式

三、DNA严重损伤时需要进行重组修复

四、跨越DNA损伤的复制后修复

第三节DNA损伤和修复的意义

一、DNA损伤具有双重效应

二、DNA损伤修复障碍与多种疾病相关

教学方法

以DNA损伤的多种机制及其修复方法为主线,讲授过程中联系前面已讲授的DNA复制过程的知识,充分利用多媒体课件,使抽象的内容形象化。

第五章 基因表达

教学目的与要求

【掌握】

1. mRNA、tRNA,rRNA在翻译过程中的作用和相互配合关系。

2. 遗传密码的特点

3. 密码子和反密码子的关系

【熟悉】

1. 遗传密码表的用法

2. 翻译的起始、肽链的延长、肽链的终止过程

3. 翻译后的加工

【了解】

1. 原核、真核生物翻译起始的异同

2. 蛋白质生物合成与医学的关系

教学内容

第一节 RNA的转录合成

一、mRNA是翻译的直接模板

二、核蛋白体是肽链合成的场所

三、tRNA和氨基酰-tRNA

第二节 蛋白质的生物合成——翻译

一、翻译的起始

二、肽链的延长

三、肽链合成的终止

教学方法

以蛋白质生物合成所需的条件为主线,将真核生物和原核生物的蛋白质生物合成过程作比较,充分利用多媒体课件动画的形式使内容直观化。

第六章 基因表达调控

教学目的与要求

【掌握】

1. 基因表达的概念

2. 乳糖操纵子调节机制

3. 顺式作用元件和反式作用因子

【熟悉】

1. 基因表达调控的基本原理

2. 原核基因转录调节特点

3. 真核基因组结构特点

4. 真核基因表达调节特点

【了解】

1. 基因表达的方式

2. 其他转录调节机制

教学内容

第一节 基因表达调控基本概念与原理

一、基因表达的概念

二、基因表达的时间性及空间性

三、基因表达的方式

四、基因表达调控的生物学意义

五、基因表达调控的基本原理

第二节 原核基因转录调节

一、原核基因转录调节特点

二、乳糖操纵子调节机制

三、其他转录调节机制

第三节真核基因转录调节

一、真核基因组结构特点

二、真核基因表达调控特点

三、真核基因转录激活调节

教学方法

以原核生物乳糖操纵子调节机制为主线,常规讲授与多媒体教学相结合、启发式教学与课堂讨论教学相结合等教授方法。

第七章 基因组学及相关组学

教学目的与要求

【掌握】

1.基因组学概念

2.功能基因组学概念

3.蛋白质组学概念

【熟悉】

1.人类基因组计划

2.后基因组时代生命科学的发展趋势

3.功能基因组学

4.蛋白质组学

【了解】

1. 转录组学

2. 蛋白质组数据库

3. 基因组学相关领域

教学内容

第一节 基因组学

一、基因组学的概念

二、人类基因组计划

第二节 后基因组学

一、功能基因组学

二、转录组学

第三节 蛋白质组学

一、蛋白质组和蛋白质组学的概念

二、蛋白质组与基因组的比较

三、蛋白质组学研究的内容和方法

四、蛋白质组数据库

五、蛋白质组学的应用及进展

第四节 后基因组时代生命科学的发展趋势

一、基因组学研究的深入

二、基因组学相关领域

三、基因组与后基因组研究将引发医学革命

教学方法

讲授时可以先从人类基因组计划开始介绍,主要介绍最近的现代分子生物学基因组的进展,从而激发学生的兴趣。

第八章 细胞信息传导

教学目的与要求

【掌握】

1. 细胞间信使物质与细胞内信使物质(第二信使)

2. 受体的概念、分类、

3. 受体作用的特点

4. 膜受体介导的信息传递方式

5. 胞内受体介导的信息传递

【熟悉】

1. 受体的结构与功能及受体活性的调节

2. 信息传递途径的交互联系

【了解】

信息传递与疾病

教学内容

第一节 信息物质

一、细胞间信息物质

二、细胞内信息物质

第二节 受体

一、受体的分类、一般结构及功能

二、受体作用的特点

三、受体活性的调节

第三节 信息的传递途径

一、膜受体介导的信息传递

二、胞内受体介导的信息传递

第四节 信息传递途径的交互联系

第五节 信息传递与疾病

教学方法

细胞信息传递是当今生命科学研究的热点,如果细胞间不能准确有效地传递信息,机体就可能出现代谢紊乱、疾病甚至死亡。讲授时可先从临床某一由于细胞信息传递障碍引起的疾病(如霍乱)开始介绍,说明学习本章的重要性,从而激发学生的学习兴趣。膜受体介导的信息传递途径是本章的重点,也是本章的难点。讲授时首先让学生明白细胞间信息传递是跨膜的信号转导,包括以下步骤:特定的细胞释放信息物质→信息物质扩散或经血循环到达靶细胞→与靶细胞的受体特异性结合→受体对信号进行转换并启动靶细胞内信使系统→靶细胞产生生物效应。抓住了这个规律,就很容易理解每一条具体的信息传递途径。 第十一章 细胞异常增生性疾病的分子机制

【掌握】

1. 癌基因

2. 抑癌基因

3. 癌基因与抑癌基因在肿瘤发生中的作用

【熟悉】

器官纤维化的分子机制

第十九章 基因操作

【掌握】

1. 核酸的理化性质

2. 基因的获取

3. 基因的克隆

【熟悉】

克隆基因的表达

【了解】

1. 基因表达的分析

2. 基因功能的分析

教学方法

讲授时可先从人类基因组计划及克隆羊多莉开始介绍,说明学习本章的重要性,从而激发学生的学习兴趣。讲授时以重组DNA技术基本原理为重点,以分、切、接、转、筛、表为主线,使复杂的内容简练化。

第二十四章 分子生物学与药物发现

【掌握】

分子生物学技术在药物发现中的应用

【熟悉】

现代分子生物学与药物发现

【了解】

传统的发现药物模式

附 录

理论教学时数分配表

中药专业、制药学专业专科分子生物学总学时数为54学时,其中理论课51学时,电教 3学时。

章节 内 容 学 时 数

绪论 2

第一章 基因的结构与功能4

第二章 基因组的结构与功能3

第三章 基因组的复制6

第四章 DNA的损伤和修复 3

第五章 基因表达6

第六章 基因表达的调控6

第七章 基因组学及相关组学3

第十一章 细胞异常增生性疾病分子机制3

第十九章 基因操作6

第二十四章 分子生物学与药物发现 3

范文十:医学分子生物学重点

第一章

概念: 基因:指贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列及表达这些信息所需的全部核苷酸序列,由核酸的一些特定碱基序列构成的表达遗传信息的功能单位。 结构基因:基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列。能参与代谢活动或维持组织结构。 调节基因:基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列。调控其他基因的表达。

基因组C值矛盾:C值是一种生=物基因组恒定的DNA含量,反映基因组大小,真核生物基因组的大小并非都与其进化程度呈正相关的现象为C值矛盾。

同一物种不同个体基因组存在DNA多态性,且约10%多态性位点导致限制性酶切位点的形成或消失,因而所含限制性酶切位点的数目和分布不同,其限制性片段的种类和长度也不同。

指在基因组水平上由单个核苷酸变异产生的DNA多态性。 真核细胞和原核细胞基因结构的差异(断裂基因) 真核细胞基因组特点:如非编码序列占绝大部分、重复序列、基因家族:染色体DNA是线性分子,含复制起点、着丝粒DNA、端粒等功能元件;细胞核DNA形成染色体结构,染色体数目一定,体细胞一般是二倍体;基因组序列中仅有不到10%是编码序列;基因在基因组中散在分布;基因组序列中包含高度重复序列、中度重复序列等大量重复序列;蛋白质的编码序列大都属于单一序列;存在各种基因家族;含大量转座元件。 原核细胞基因组特点:如编码序列占绝大部分、类核、质粒:基因组DNA通常为单一闭环双链分子,只有一个复制起点;基因组序列的50%是编码序列;非编码序列主要是一些调控序列;所含基因的数目比病毒多,并且多形成操纵子结合。 病毒基因组特点:如重叠基因:所含核酸的种类与结构、分子数不同;基因组较小,为单倍体并且所含基因为单拷贝;基因组序列基本上都是编码序列;基因的连续性不同;相关基因串联成一个转录单位。

第五章

概念: 基因表达:是由基因指导合成功能产物RNA和蛋白质的过程,体现了DNA与蛋白质、基因型与表型、遗传与代谢的关系。 管家基因:编码细胞基本组分的基因和细胞基本代谢相关基因。 顺式作用元件:是基因序列的一部分,是RNA聚合酶或调节蛋白的结合位点,包括启动子、终止子,原核生物的操纵基因和激活蛋白结合位点、真核生物的增强子和沉默子等。

反式作用因子:反式作用元件即调节基因,通过编码产物调控基因表达,其编码产物为反式作用因子。 正调节:指调节蛋白与调控序列结合促进基因表达。 负调节:指调节蛋白与调控序列结合阻遏基因表达。 增强子:是真核生物促进转录的一类调控序列,与启动子可以相邻、重叠或包含,通过结合调节蛋白、改变染色质构象而促进一种或一组基因的转录。 印迹基因:来自父母的本源基因,一方表达一方不表达。 原核生物基因表达调控的特点:①既有正调节,又有负调节②调节蛋白都是DNA结合蛋白③存在衰减调控机制④存在应急应答调控机制 操纵子的基本结构:一个启动子、一个操纵基因及其所控制的一组功能相关的结构基因等组成。

乳糖操纵子的两种调控模式:P118

①阻遏调控:负性调控

②激活调控:正性调控

色氨酸操纵子的两种调控模式:P119

①阻遏调控:粗调

②衰减调控:细调 真核生物基因表达调控的特点:①既有瞬时调控,又有发育调控②调控环节更多③染色质结构变化影响转录效率④转录调控以正调控为主⑤调控序列多并且可以远离转录区⑥调节蛋白种类繁多,调节机制复杂 组蛋白乙酰化是活性染色质的标志:

基因转录效率高。 增强子的特点:①增强效应十分明显②增强效应与增强子所处的位置和取向无关③没有基因特异性④具有组织细胞特异性⑤多含重复对称序列⑥增强子的作用具有协同性⑦许多增强子的作用受环境信号影响。 真核生物转录后调控方式:①加帽和加尾②转运

第六章

概念: 细胞通讯:细胞之间通过内环境进行的信息传递过程。 信号转导:将一种信号转换成另一种信号,最终产生细胞应答,包括代谢物水平和代谢速度的改变,导致细胞的生长、分裂、分化、衰老、死亡速度的改变的过程。 信号转导通路:信号传递过程发生的一系列有序化学反应。 第一信使:亲水性信号分子,包括氨基酸、氨基酸衍生物、活性肽和蛋白质。 第二信使:第一信使与膜受体结合,引起细胞内一些小分子物质浓度的改变,这些小分子物质是下游效应蛋白的变构剂,通过对效应蛋白进行变构调节来转导信号。其小分子物质为第二信使。 受体与配体:受体是一类细胞膜跨膜蛋白或细胞内可溶性蛋白,配体是信号分子,配体可直接与受体特异性结合而变构激活,触发信号转导,产生生物学效应。 细胞通讯方式类型:①细胞间隙连接通讯②细胞表面分子接触通讯③化学信号通讯 受体类型

活化:G蛋白偶联受体发生变构,作用于Ga ▪GDP,使其释放GDP,结合GTP;然后Ga ▪GTP与Gβγ解离,彻底激活。

失活:GTP酶激活蛋白,促使小G蛋白的GTP酶活性,使其水解GTP而失活。

蛋白激酶和蛋白磷酸酶P143:

蛋白激酶A途径:P147

首先由细胞外信号触发细胞内第二信使IP3、DAG的产生和Ca2+的释放,继而由第二信使触发蛋白激酶C途径和钙调蛋白途径。

第七章 核酸提取的主要步骤:①破碎细胞②除去与核酸结合的蛋白质、多糖等生物大分子③分离核酸④除去其他杂质

试剂的作用:

蛋白酶K(水解由脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸的羧基形成的肽键,使DNA游离)、

EDTA(使细菌悬浮)、SDS(去污剂裂解细胞、使蛋白质变性)、巯基乙醇(快速裂解细胞,解离和蛋白,释放RNA)、溴化乙锭(染色、解旋DNA)、上样缓冲液(监测电泳进程,增加样本密度)、ddNTP(DNA测序) 核酸纯度判定比值

①纯度较高的DNA OD280≈1.8 如果OD280>1.8 可能含有RNA或DNA部分降解

如果OD260

OD280OD260OD260可能含有苯酚或蛋白质

OD260

OD280①纯度较高的RNA

OD260≈1.8—2.0 如果OD260OD280

DNA测序自动化

第八章

概念: 杂交:不同来源单链核酸的退火。 探针:是用于指示特定物质的性质或状态的一类标记分子。 印迹:是指将核酸和蛋白质等样品用类似于吸墨迹的方法从凝胶等电泳或层析介质中转移到合适的印迹膜上,样品在印迹膜上的相对位置与在凝胶中时一样。

①电泳分离:DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳按长度分离;为了保持RNA呈单链状态进行电泳,以使RNA按分子大小分离,需要先用变性剂将RNA样品完全变性,在通过琼脂糖凝胶电泳。②变性:DNA用碱液处理电泳凝胶;RNA只能用甲醛、乙二醛、二甲亚砜等变性。

对应的英文简称

第九章

基因芯片的原理:先将大量已知序列的DNA片段作为探针按照一定的阵列高密度固定于基片表面,这样阵列中的每一个点实际上代表了一种特定基因,然后与用荧光素标记的待测核酸进行杂交。用专门仪器检测芯片上的杂交信号,经过计算机分析处理,获得待测核酸的各种信息。

第十章

DNA聚合酶、DNA引物、dNTP原料、目的DNA模板和缓冲溶液等。

多重PCR、AS-PCR、RT-PCR、Q-PCR的应用:基因组DNA扩增、基因分离、基因克隆、克隆鉴定、定点诱变、突变鉴定、探针制备、DNA测序等。

第十二章

概念: 单基因病:指发病只涉及一对等位基因的遗传病。 多基因病:是复杂遗传病,由多对等位基因共同控制,这些基因是共显性的,通过功能的叠加效应共同决定多基因遗传病的表型。 主效基因:对于同一性状的表型来讲,几个非等位基因中的每一个都只有部分的影响,这样的几个基因称为累加基因或多基因。在累加基因中每一个基因只有较小的一部分表型效应,所以又称为微效基因。相对于微效基因来讲,由单个基因决定某一性状的基因称为主效基因 毒力:是指其致病的能力,是侵袭力和毒力因子的综合效应。

遗传病的种类

①基因病:单基因遗传病、多基因遗传病

②染色体病:常染色体病、性染色体病

③线粒体基因病

血友病A和DMD(假肥大型肌营养不良症)的遗传方式: X连锁隐性遗传病。 血友病A和DMD(假肥大型肌营养不良症)的致病基因:

血友病A 是凝血因子Ⅷ基因F8异常。 DMD基因

乙肝病毒和HIV病毒的遗传物质结构:

乙肝病毒的遗传物质是DNA,由两股不等长DNA链构成的非闭环双链DNA,长链为负链DNA,短链为正链DNA。

HIV病毒的遗传物质是ssRNA(单链RNA)

乙肝病毒基因组复制方式:感染后,半环状的DNA链会以负链为模板,在催化剂——HBV-DNA聚合酶的作用下延长,最终形成完整的环状。

是对HBsAg、HBcAg、HBeAg及其抗体的检测。

大三阳:HBsAg+、抗HBc+、HBeAg+

小三阳:HBsAg+、抗HBc+、抗HBe+

第十三章

概念:

基因诊断:是直接检测基因组中致病基因或疾病相关基因的改变,或病原体基因的存在,并以此作为疾病的诊断指标。

连锁分析:分析与该致病基因连锁的遗传标志。

基因治疗:最初是指把正常基因导入靶细胞,与染色体DNA整合,成为基因组的一部分,从而发挥正常基因功能,治疗疾病;现在是指把缺陷基因的野生型拷贝导入患者细胞内,以治疗疾病。

基因治疗的基本策略:

① 因增补②基因置换③基因修补④基因干预⑤自杀基因治疗⑥免疫基因治疗

外源基因的导入方法分类:

①病毒载体法

②非病毒载体法

外源基因的导入途径分类:

①ex vivo途径:又称体外基因治疗,是先从患者体内获取靶细胞,进行体外培养,然后导入正常基因,回输到患者体内,使其在体内表述以达到治疗的目的。

② in vivo途径:又称体内基因治疗,是将正常基因直接导入体内,使其进入相应细胞表达之后发挥途径作用。